PPGBIO - Dissertações

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Identificação fenotípica e genotípica de enterococos isolados de leites e queijos de ovelhas para emprego futuro como probióticos
(2021-07-14) Souza, Débora Buzatto de; Frazzon, Ana Paula; Frazzon, Jeverson; Programa de Pós-Graduação em Biociências
Os enterococos são bactérias amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas também em alimentos. Nestes, seus metabólitos contribuem para o desenvolvimento de propriedades sensoriais. Além disso, a capacidade de algumas cepas em produzir peptídeos antimicrobianos (enterocinas) e compostos ácidos com atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas e deteriorantes de alimentos, são benéficos na indústria de alimentos. Entretanto, devido à sua capacidade de adquirir determinantes genéticos de virulência e resistência a antimicrobianos, aliado ao caráter oportunista de algumas espécies, esse gênero não possui o status de Generally recognized as safe (GRAS). A presença de enterococos resistentes a antimicrobianos e virulentos em diferentes tipos de alimentos tem sido amplamente estudada, entretanto em leites de ovelhas e queijos, são poucas as pesquisas realizadas. Tendo em vista o exposto, o objetivo do presente estudo foi identificar bactérias do gênero Enterococcus spp. em leites e queijos de ovelhas, obtidos da produção da região sul do Brasil, quanto à espécie, suscetibilidade a antimicrobianos e presença de genes de resistência e virulência, visando identificar possíveis cepas para estudos futuros de avaliação do potencial probiótico. Cento e cinquenta e seis enterococos foram isolados de amostras de leites e queijos colonial, tipo feta e tipo pecorino, identificados por MALDI-TOF, testados para suscetibilidade antimicrobiana e rastreados para genes de resistência e virulência. Os resultados do presente estudo demonstraram que E. faecalis foi a espécie mais frequente nas amostras de leites e queijos de ovelha. Porém, quando demonstrado por queijos, as amostras de queijo colonial apresentaram a maior diversidade de espécies (E. faecium, E. faecalis, E. durans e E. gallinarum) quando comparadas aos demais tipos de queijos. Nos queijos tipo feta foram isoladas as espécies E. durans (65,52%) e E. faecalis (34,48%), enquanto no tipo pecorino, apenas E. faecalis (100%) foram encontrados. Todos os isolados foram sensíveis à ampicilina, linezolida e vancomicina. Alta porcentagem de isolados não suscetíveis a pelo menos um antimicrobiano foi demonstrada, sendo tetraciclina, eritromicina, nitrofurantoína, rifampicina e estreptomicina os antimicrobianos com maior ocorrência. Os msrC e ermB genes foram detectados em 28,81% e 11,11% dos isolados não susceptíveis a eritromicina, respectivamente. Além disso, os genes tetM (98,04%) e tetL (54,90%) foram detectados nas cepas não suscetíveis à tetraciclina. Dezesseis isolados suscetíveis a todos os antibióticos avaliados foram testados quanto à presença dos genes de virulência ace, agg, cylA e gelE. Apenas 7 não apresentaram nenhum gene, sendo necessários estudos futuros para seu emprego como probiótico. Este trabalho demonstra a alta frequência (89,74%) de cepas de Enterococcus spp. resistentes e/ isolados de leites e queijos de ovelha, assim como a presença de possíveis cepas candidatas para estudos futuros para avaliação da sua capacidade probiótica.
Biodegradação de polietileno: um estudo sobre a atividade de fungos cultiváveis oriundos de larvas de Galleria mellonella
(2024-08-26) Oliveira, Maria Luísa de; Trentin, Danielle da Silva; Menezes, Gabriela Messias Miranda; Programa de Pós-Graduação em Biociências
O polietileno (PE) é, atualmente, o plástico mais consumido no mundo e, por ser um polímero resistente a agentes químicos e à biodegradação, os atuais métodos de gerenciamento de resíduos plásticos não conseguem, de forma eficaz, reduzir e/ou eliminar o PE do meio ambiente. Devido a este panorama, surge a necessidade de métodos alternativos que reduzam o impacto que o acúmulo de resíduos plásticos tem causado nas vidas aquática e terrestre. Larvas do inseto Galleria mellonella têm sido reportadas como capazes de biodegradar o PE, inclusive mais rapidamente do que microrganismos ambientais. Até o momento, há apenas três relatos na literatura sobre a biodegradação de PE por fungos filamentosos provenientes do intestino de G. mellonella, a saber: dois focados em Aspergillus flavus e um em Cladosporium halotolerans. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de biodegradação do PE por fungos cultiváveis provenientes de larvas de G. mellonella. Glândulas salivares e intestino foram dissecados dos animais e utilizados como inóculo microbiano em meio de cultivo líquido. Os 16 fungos isolados (11 fungos filamentosos – Aspergillus flavus, A. spathulatus, Epicoccum triodiae, E. viticis, Peniophora lycii, e Robbauera albescens – e 5 leveduras – Rhodotorula mucilaginosa e Moniliella pollinis) foram posteriormente identificados por técnicas microbiológicas cultural e molecular, e isolados foram selecionadoss e cultivados com filmes de polietileno de baixa densidade (PEBD) como única fonte de carbono. Para os isolados M. pollinis, A. flavus e A. spathulatus foi observada presença de produtos intermediários apolares provenientes da biodegradação do PE, como por exemplo os hidrocarbonetos pentacosano, tetracontano, e heneicosano, através da análise do sobrenadante do cultivo por CG-EM. Além disso, foi investigada a capacidade dos fungos em biomineralizar o PEBD em seu produto final de biodegradação através da quantificação da produção de CO2 durante seu contato com PEBD. A maior atividade foi observada para a levedura Moniliella pollinis (GYPE3) com liberação de 21,41±1,56 mg de CO2 e 5,73%±0,42 de biomineralização após um período de 24 dias; estes dados foram superiores aos reportados para Fusarium redolens e para o consórcio formado Aspergillus niger, Gliocladium virens, Penicillium pinophilum e Phanerochaete chrysosporium. Este trabalho evidencia a ação de fungos, destacando leveduras, como agentes de biodegradação de PE e auxiliará no desenvolvimento futuro de novas tecnologias para o manejo de resíduos plásticos visando eliminar o seu acúmulo no meio ambiente.
Explorando a biologia do inseto Galleria mellonella para o desenvolvimento de novos agentes contra bactérias multirresistentes
(2024-06-24) Luz, Letícia Feliciani da; Trentin, Danielle da Silva; Menezes, Gabriela Messias Miranda; Programa de Pós-Graduação em Biociências
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que até 2050 mais de 10 milhões de pessoas irão morrer anualmente de infecções se a resistência aos antimicrobianos for mantida no nível atual, constituindo a principal causa de morte humana. Produtos naturais são reconhecidos como importante fonte de entidades químicas para o desenvolvimento de agentes anti-infectivos. No ambiente, os insetos são constantemente ameaçados por patógenos e, portanto, desenvolveram estratégias para se proteger de infecções microbianas. O inseto Galleria mellonella apresenta ciclo de vida dividido em quatro fases (ovo, larva, pupa e mariposa adulta). Após a oviposição, os ovos ficam expostos no ambiente, mas ainda não é conhecida a forma pela qual os mesmos se protegem de microrganismos. Adicionalmente, antes da formação de pupa, as larvas são envoltas em um casulo de seda. Assim, os ovos e os casulos de seda parecem proteger G. mellonella dos ataques de microrganismos. Alguns insetos, podem apresentar um processo denominado priming imunológico: a exposição a sub-doses de microrganismos ativa a resposta imune e confere efeito protetor a um próximo contato com o patógeno. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade antibacteriana e antibiofilme de extratos dos ovos e casulos de seda de G. mellonella, provenientes de larvas expostas ou não a antígenos bacterianos, frente a cepas bacterianas multirresistentes, contribuindo no desenvolvimento de novos agentes anti-infectivos e no entendimento de como G. mellonella se protege de infecções. Especificamente, investigou-se também se os ovos provenientes de larvas expostas a antígenos bacterianos apresentam modificação química e morfológica, e se a exposição aos antígenos afeta a atividade anti-infectiva dos extratos de ovos. As análises histológicas e de MEV-FEG-EDS apontaram espessamento da camada mucosa de ovos desafiados. Extratos aquosos e orgânicos foram obtidos de casulos saudáveis, bem como de ovos controle e desafiados com antígenos bacterianos. Os materiais biológicos apresentaram alterações na composição química antes e após a extração, conforme observados pelas técnicas de FTIR e MEV-FEG. Por meio da análise de CG-MS, foram identificados 43 compostos provenientes dos extratos de casulos e 39 compostos dos extratos de ovos, dos quais vários tem sido reportados na literatura por possuírem ação antibacteriana e/ou antibiofilme. Os extratos foram avaliados, na concentração de 1000 e 350 µg/mL, quanto à ação antibiofilme e antibacteriana pelas técnicas de cristal violeta e microdiluição em caldo, respectivamente. Os extratos CE1, CE3, EE1 e EE2 destacaram-se por sua excelente atividade antibacteriana e/ou antibiofilme que foram obtidas frente a Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus multirresistentes A identificação de moléculas bioativas capazes de controlar o crescimento ou a virulência de bactérias multirresistentes, através de mecanismos de ação distintos dos antibacterianos clássicos, contribuirá para o desenvolvimento de agentes inovadores no setor farmacêutico e no entendimento da biologia e fisiologia dos insetos.
Otimização, caracterização e estudo de estabilidade de uma formulação de hidrogel termorresponsivo para o tratamento da disfunção erétil
(2023-09-28) Frohlich, Anna Lúcia; Aguirre, Tanira Alessandra Silveira; Programa de Pós-Graduação em Biociências
A disfunção erétil (DE) é a dificuldade de atingir ou manter o estágio de ereção do pênis. A principal terapia da DE são os iPDE5, como principal exemplo o Viagra®, que apresenta algumas contraindicações e efeitos adversos potencialmente perigosos; além de que cerca de 35% dos pacientes não respondem ao tratamento. PNPP19 é uma terapia inovadora para o tratamento da DE, sendo uma molécula peptídica instável e sujeita a diversas reações de degradação, fazendo-a perder sua atividade biológica. Por isso, partindo de uma formulação prévia incompatível com a forma de administração, este trabalho teve como objetivo otimizar uma formulação que fosse capaz de melhorar a estabilização do peptídeo PnPP19 e que facilite a sua administração tópica, incrementando viscosidade. Para isso, foram realizados ensaios de otimização sistemática da formulação, de forma a adequar a Tsolgel. Diferentes géis a base do polímero Poloxamer 407 foram preparados para a incorporação do peptídeo PnPP19. Esses géis possuem característica termorreversíveis e podem ter sua Tsolgel modulada pela modificação na concentração dos componentes. As formulações consideradas promissoras em termos de consistência e temperatura de gelificação foram avaliadas a 25 ºC por até 12 meses e a quantificação do peptídeo foi realizada por um método de HPLCDAD desenvolvido e validado. Ao final, duas formulações foram consideradas para avaliações adicionais da estabilidade do peptídeo a 5 e 40 ºC, além da caracterização reológica e de textura. A formulação atual padrão utilizada pela empresa Biozeus, possui uma consistência fluida sem formar gel e apresentou comportamento reológico Newtoniano a 35 ºC; enquanto que a formulação proposta após a otimização, forma gel à temperatura ambiente e apresentou comportamento reológico não-Newtoniano (à 35 ºC). Os estudos de estabilidade mostraram uma influência positiva do tampão fosfato na manutenção da integridade do peptídeo, apresentando resultados superiores de estabilidade em comparação com outros tampões. Também, é mostrado que o aumento da viscosidade e consequente redução da Tsolgel é importante para garantir a estabilidade para o peptídeo. No estudo de adição de aditivos de proteção microbiológica, foi mostrado que o Nipaguard® SCE, com ou sem ácido ferúlico como antioxidante, se mostrou o único sistema conservante capaz de proteger a formulação contra o crescimento de bactérias e fungos. Na avaliação de estabilidade dessas novas formulações foi mostrado que as formulações atingiram níveis similares de degradação. Conclui-se que a formulação otimizada que apresenta consistência adequada para facilitar a aplicação tópica, apresentou melhores resultados de estabilização em relação à fórmula padrão nas condições avaliadas de 5, 25 e 40 ºC. Para a proteção microbiana, foi evidenciado Nipaguard® SCE como sendo o melhor conservante avaliado para essa aplicação.
Nova metodologia analítica para determinação de anti-inflamatórios não esteroides em amostras de urina por microextração em membrana utilizando solvente supramolecular
(2024-07-03) Monteiro, Sofia Aquino; Merib, Josias de Oliveira; Programa de Pós-Graduação em Biociências
Os anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) são uma classe de medicamentos com efeito antipirético, analgésico e anti-inflamatório que são amplamente utilizados em todo o mundo. Pensando no impacto toxico-social do uso indiscriminado desses medicamentos, este estudo teve como objetivo desenvolver uma metodologia de preparo de amostras baseada em princípios verdes para a determinação de seis AINEs em amostras de urina, através da cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detecção por arranjo de diodos (HPLC-DAD). O fluxo de trabalho experimental consistiu em uma técnica de microextração líquido-líquido com membrana microporosa oca (HF-MMLLE) usando um solvente supramolecular imobilizado nos poros de membranas de polipropileno (1 cm de comprimento). Essas membranas foram acopladas a um sistema semiautomatizado de 96 poços para permitir múltiplas extrações simultaneamente. Sob as condições otimizadas, os limites de detecção (LODs) e os limites de quantificação (LOQs) variaram de 6,06 a 30,3 µg L -1 e de 20 a 100 µg L -1 , respectivamente. As faixas lineares variaram de 20 a 1000 µg L -1 para indometacina e diclofenaco, de 50 a 1000 µg L -1 para cetoprofeno e ibuprofeno, e de 100 a 1000 µg L -1 para naproxeno e fenoprofeno. Os coeficientes de determinação (R²) variaram de 0,9735 a 0,9997. A precisão intradia variou de 6,13 a 20,11% e a precisão interdia variou de 2,87 a 20,72%. Os valores referentes a exatidão, em termos de recuperação variaram de 92,49 a 126,89%. Além disso, a métrica de sustentabilidade no preparo de amostras recentemente proposta (SPMS) foi empregada, resultando em uma pontuação de 8,0, considerada altamente satisfatória de acordo com os conceitos da química analítica verde.
Avaliação de metodologia analítica para determinação de Compostos Orgânicos Semivoláteis (SVOCs) em água utilizando microextração líquido- líquido dispersiva e cromatografia gasosa
(2024-04-03) Silva, Lauren Ramos da; Merib, Josias de Oliveira; Programa de Pós-Graduação em Biociências
A contaminação ambiental por poluentes orgânicos se tornou um problema ambiental e econômico em escala mundial. Não é de hoje que inúmeras áreas são propensas a contaminações de diversos tipos que incluem os mais variados agentes poluentes. Desta forma, leis e regulamentações têm sido criadas com o intuito de reduzir este problema que está disseminado no mundo todo. Em 1972, ocorreu a Convenção de Estocolmo, nela foram apresentados os Poluentes Orgânicos Persistentes (POPs) compostos à base de carbono com tempo de meia-vida alto, que não sofrem degradação no meio ambiente e por isso podem se distribuir e acumular no meio ambiente, sofrendo biomagnificação e apresentando alta toxicidade aos seres humanos e ao meio ambiente. Dentre os POPs estão os Compostos Orgânicos Semivoláteis (SVOCs) que apresentam volatilidades intermediárias, ou seja, são abundantes tanto na fase condensada quanto na fase de vapor em pressão e temperatura ambientes. Os SVOCs são um grande grupo de compostos orgânicos que se subdividem em diversos outros grupos como os Pesticidas Organoclorados, Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (PAHs), Bifenilas Policloradas (PCBs), Ftalatos, e muitos outros. Neste trabalho foi proposto o desenvolvimento, otimização e validação de uma metodologia analítica para a determinação de SVOCs em água por microextração líquido-líquido dispersiva e cromatografia gasosa. A metodologia é uma alternativa mais sustentável em comparação com as metodologias oficiais para a análise de água da torneira, água do mar, água tratada, água subterrânea e água de lagoa. O fluxo de trabalho experimental foi parcialmente otimizado usando um planejamento Doehlert, e 500 µL de diclorometano (solvente de extração) foram utilizados para analisar 15 mL de água. Além disso, 500 µL de metanol (solvente dispersor), 15 s de vórtice e 2 min de centrifugação também foram utilizados para a metodologia de preparo da amostra. Nessas condições foram alcançados parâmetros analíticos satisfatórios com coeficientes de determinação (r2) superiores a 0,9635, limites de detecção (LOD) de 3,0 a 6,0 µg L-1, limites de quantificação (LOQ) de 10,0 a 20,0 µg L-1, precisão intradiária de 1,66 a 29,50% e precisão interdiária de 9,32 a 23,54%.
Avaliação da atividade anti-herpética do exsudato de Salvia uliginosa e do diterpeno icetexona
(2023) Monteiro, Maria antônia Cabrla; Rodrigues Júnior, Luiz Carlos; Romão, Pedro Roosevelt Torres; Programa de Pós-Graduação em Biociências
Herpes Simples Virus-2 (HSV-2) é um vírus dermatotrópico. Estudos recentes indicam que a porcentagem de indivíduos infectados pelo HSV-2 no Brasil é em média 11,3% e estima-se que cerca de 90% da população mundial possui sorologia positiva por um ou ambos os vírus. O HSV-2 também é uma infecção sexualmente transmissível que ocasiona sérios problemas em indivíduos com sistema imunológico debilitado ou sob tratamento imunossupressor, ou ainda quando é transmitido durante o parto. Os antivirais já existentes para o tratamento não atuam na latência do vírus e já existem cepas resistentes ao aciclovir, principal fármaco utilizado. Tratamentos com derivados de plantas têm apresentado eficácia contra o herpes, em modelos in vitro e in vivo. Algumas espécies de Salvia já foram estudadas frente a vírus e outros microrganismos. Análises publicadas pelo nosso grupo demonstraram que Salvia uliginosa apresenta uma atividade significativa frente a Leishmania amazonensis, um parasita intracelular responsável por causar leishmaniose. Assim, o objetivo desse trabalho foi verificar o possível efeito anti-herpético de Salvia uliginosa frente ao HSV2 in vitro. Salvia uliginosa foi coletada e identificada por um botânico. O exsudato da planta e o composto majoritário, o diterpeno icetexona (ICT), foram obtidos no Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. A ICT foi isolada no mesmo laboratório, por cromatografia em coluna de gel de sílica. A técnica de MTT foi utilizada na linhagem celular VERO para a análise da citotoxicidade dos extratos e composto isolado, determinando os valores de IC50 e CC50. O efeito virucida das amostras no HSV-2 foi avaliado por ensaio de placa. Os resultados indicaram que o exsudato de S. uliginosa possui atividade antiherpética in vitro, com CC50 de 193,5μg/mL, embora a ICT não. São necessários experimentos adicionais in vitro para elucidar o mecanismo de ação, e in vivo para testar a hipótese anti-herpética da Salvia uliginosa no hospedeiro infectado.
Análise da relação de soropositividade pra citomegalovíryus e o perfil de linfócitos t em indivíduos com sobrepeso ou obesidade
(2023) Lima, Diego Del Duca; Rodrigues Júnior, Luiz Carlos; Peres, Alessandra; Programa de Pós-Graduação em Biociências
O citomegalovírus humano (HCMV) ou herpes vírus humano tipo 5 (HHV-5) é um vírus altamente prevalente na espécie humana, sendo endêmico em todo o mundo, estando envolvido em inúmeras doenças leves ou severas. Após a primeira infecção, o HCMV permanece em estado de latência no hospedeiro, a partir do qual pode ser reativado quando ocorre uma baixa na resposta imunológica ou em situações de estresse. Estudos recentes indicam que o processo inflamatório pode estar associado a reativação do HCMV no hospedeiro. A obesidade é um problema mundial relacionado a um quadro inflamatório crônico e subclínico, devido a produção de citocinas e células com perfil inflamatório, predispondo pacientes obesos ao desenvolvimento de uma série de doenças crônicas. Um indivíduo obeso, e no curso de uma reativação de HCMV pode apresentar características diferenciadas no processo inflamatório, caracterizadas por um sinergismo da reposta antiviral e inflamação. Assim, nesse estudo foi realizada uma análise da soropositividade para HCMV em indivíduos com diferentes níveis de sobrepeso, e sua relação com parâmetros bioquímicos, inflamatórios e os marcadores fenotípicos de ativação linfocitária. O projeto foi aprovado pelo comitê de ética da UFCSPA com o número 63282416.6.0000.5345. Os dados foram obtidos a partir de um banco de dados com 113 indivíduos que foram classificados em eutróficos, sobrepeso e obesos de acordo com o IMC. Todos os participantes eram do sexo masculino com média de idade de 34,72 anos. Foram avaliados dados relacionados ao perfil bioquímico como glicose, triglicerídeos, colesterol, HDL e LDL ao perfil fenotípico de células T de acordo com os marcadores+, CD4, CD8, CD4+CD25+CD39+, CD4+CD25-CD39+, CD8+CD27+CD28+, CD8+CD27-CD28-Os resultados indicam que a presença do HCMV contribui para um aumento na frequência das células T de memória altamente diferenciadas, com fenótipo senescente, os indivíduos com sobrepeso e obesidade
Efeito da modulação de NEK1 na expressão gênica da família NEK em células de glioblastoma
(2022) Cunha, Rick Shandler Rodrigues da; Moura, Dinara Jaqueline; Programa de Pós-Graduação em Biociências
O glioblastoma multiforme (GBM) é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral primário em adultos. O tratamento pouco efetivo com radioterapia e temozolomida (TMZ) traz a necessidade de busca por novas terapias e alvos terapêuticos, e a Nek1, primeira proteína da família NEK descrita, é uma candidata. A proteína Nek1 tem sido descrita como alvo relevante para resposta terapêutica em GBM, sendo sua expressão correlacionada com a resistência à TMZ em pacientes. Para entender melhor a relação entre Nek1 e os demais membros da família NEK no contexto de GBM, o presente estudo fez o uso do The Cancer Genome Atlas (TCGA) e do Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2 (GEPIA2) para realizar uma análise de correlação. As NEKs que apresentaram maior correlação nestes estudos in silico foram avaliadas em estudos de expressão de RNA in vitro, utilizando células U87 knockout (KO) para NEK1. A expressão destas proteínas da família NEK foram comparadas em condições de tratamento com o radiomimético zeocina e com o alquilante TMZ. NEK4, NEK5, NEK9 e NEK11 apresentaram a maior correlação com NEK1. As células U87 KO de NEK1 tratadas com zeocina apresentaram uma maior expressão de NEK9 e NEK11 quando comparadas com a U87 selvagem. Já o tratamento com TMZ diminui a expressão de NEK4, NEK5, NEK9 e NEK11 em células U87 com KO de NEK1. A diminuição da expressão de NEK4 foi a única que persistiu no cotratamento com zeocina e TMZ. Estes dados demonstram uma clara associação entre os membros da família NEK no contexto de GBM, devendo essa relação ser melhor investigada.
Microbiota do trato respiratório superior de pacientes com infecção respiratória e sua associação com sars-cov-2
(2023-01-24) Rosa, Jordana Ariane Nunes da; Seixas, Adriana; Veiga, Ana Beatriz Gorini da; Programa de Pós-Graduação em Biociências
O coronavírus SARS-CoV-2 emergiu no final de 2019, causando a COVID-19, uma doença respiratória aguda declarada pandemia pela Organização Mundial de Saúde em março de 2020. Os fatores associados à suscetibilidade e à gravidade da infecção causada pelo SARS-CoV-2 ainda não estão bem definidos, e perfis bastante diferentes são observados nos pacientes variando de assintomáticos a morte. A microbiota do trato respiratório superior funciona como uma primeira barreira contra o ataque de infecções de qualquer origem. A microbiota compreende uma comunidade de microrganismos, como fungos, bactérias e vírus, os quais podem ser comensais ou potencialmente patogênicos. Esses microrganismos formam interações que influenciam perfis de saúde ou doença do hospedeiro. Desta forma, a caracterização das comunidades bacterianas no trato respiratório superior de pacientes com diferentes níveis de gravidade de COVID-19 pode fornecer evidências sobre potenciais associações entre a microbiota e o risco de condições clínicas mais graves da doença. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar a comunidade bacteriana presente em amostras de nasofaringe de pacientes com Síndrome Gripal (SG) ou com Síndrome Respiratória Aguda Grave (SRAG), infectados (+) e não infectados (-) por SARS-CoV-2. Amostras de 96 pacientes foram avaliadas utilizando sequenciamento massivo de amplicons da região V4 do gene 16S RNA ribossomal. A seleção das amostras foi baseada em uma amostragem estratificada aleatória, a partir de variáveis estratificadoras estabelecidas previamente como síndromes, diagnóstico para SARS-CoV-2, e idade. Segundo os critérios anteriores, as amostras foram divididas em 4 grupos: pacientes com sintomas de SG, positivos e negativos para SARS-CoV-2 (grupos SG+, e SG-); e pacientes apresentando SRAG, positivos e negativos para SARS-CoV-2 (grupos SRAG+, e SRAG-), considerando dois grupos etários 20 – 40 anos e ≥ 60 anos. Em comparações de beta diversidade, considerando primeiramente a idade dos pacientes (20 – 40 anos e + 60 anos), foram encontradas diferenças significativas entre os grupos SRAG+ e SRAG-. Considerando os sintomas respiratórios (SG ou SRAG) e diagnóstico para SARS-CoV-2, também foram encontradas diferenças significativas de beta diversidade entre o grupo SG+ e o grupo SRAG+; e entre os grupos SRAG+ e SRAG-. Em comparações de alfa diversidade, medida pelo índice de Shannon, houve diferenças significativas entre os grupos SG+ e SRAG+, sendo que o grupo SRAG+ apresentou diminuição na diversidade bacteriana no nível de gênero (p < 0,05). Além disso, a composição da microbiota da nasofaringe dos grupos de estudo foi caracterizada por uma abundância relativa de alguns táxons, incluindo os gêneros Staphylococcus spp., Corynebacterium spp., Shigella spp., Acinetobacter spp., Enterococcus spp., e Caloramator spp. Verificamos, ainda, que o grupo SG+ apresentou como táxon diferencialmente abundante o gênero Bacillus spp., enquanto no grupo SRAG+ esse gênero não foi encontrado. Em contrapartida, o grupo SRAG+ apresentou Streptococcus spp., Veillonella spp. e Staphylococcus spp. como gêneros diferencialmente abundantes quando comparados ao grupo SRAG-, que teve o gênero Bacillus spp. como o mais abundante. Tendo em vista os resultados, nosso estudo identificou diferenças significativas nos perfis da microbiota de pacientes SG em comparação com SRAG, infectados com SARS-CoV-2. Esses dados contribuem para a compreensão do papel da microbiota como indicador de suscetibilidade à infecção por SARS-CoV-2 e gravidade da doença, além de ajudar a estabelecer associações entre o perfil de microbiota e os tipos de desfechos clínicos da COVID-19.
Papel da amígdala medial póstero-dorsal no controle central da atividade cardiovascular de ratos: modulação neuroquímica e resposta à restrição hídrica
(2018) Oliveira Filho, Fernando Aparecido de; Rasia Filho, Alberto Antonio; Rodrigues, José Antunes
O subnúcleo póstero-dorsal da amígdala medial (MePD) é parte relevante da circuitaria que integra comportamentos emocionais e sociais e controle central cardiovascular. Aqui, estudamos a atividade hemodinâmica basal e as respostas cardiovasculares reflexas após microinjeções de salina (0,3L, n=7), vasopressina (VP, 1pg ou 100pg/0,3 L, n= 5-7), substância P (SP, 10ng ou 100ng /0,3 L, n= 4-6); colecistoquinina (ou colecistocinina, CCK, 10nM ou 100 nM/0,3 L, n= 4/grupo), e L-Arginina (L-Arg, 2,87 nM ou 100 nM/0,3 L, n= 4-5) no MePD de ratos machos, adultos e não anestesiados. As respostas barorreflexas e quimiorreflexas foram testadas. Análise espectral e simbólica dos dados foram realizadas para avaliar a atividade central nos componentes simpáticos e parassimpáticos na variabilidade da frequência cardíaca (FC) e da pressão arterial (PA). A seguir, testamos o quanto o glutamato (2 μg/0,3 μl), quando microinjetado na MePD, é capaz de modular a resposta central à privação de água, com alterações no volume sanguíneo e osmolaridade e, consequentemente, na PA e FC. Os resultados mostraram que a VP aumentou consistentemente os parâmetros da análise espectral, o que indica uma maior resposta simpática, SP induziu um efeito dose-dependente e aumentou tanto a sensibilidade do barorreflexo e a FC provocada pelo quimioreflexo e parâmetros de análise espectral e simbólica com significados fisiológicos mistos, L-Arg aumentou a FC provocada pelo quimioreflexo e reduziu a atividade parassimpática central. Em relação ao equilíbrio hidromineral, ratos microinjetados com glutamato apresentaram maior consumo de água, mas não maior consumo de água e NaCl quando comparados aos ratos não submetidos à restrição hídrica. Esses dados contribuem para o avanço dos conhecimentos sobre a modulação neuroquímica e o balanço simpático/parassimpático que modula o sistema cardiovascular após estimulação periférica. O MePD também participa do controle central do apetite de sal, reduzindo-o, mas mantendo a sede e o volume de água ingerido após a desidratação. Esses achados indicam que o MePD atua para controlar a homeostase dos ajustes cardiovasculares reflexos, volume sanguíneo e PA sem induzir alto consumo de sal em ratos.
Desenvolvimento de metodologia analítica baseada em microextração em fase homogênea com solventes de hidrofilicidade comutável para determinação de cortisol e testosterona em amostras de fluido oral
(2023-07-28) Dalanhol, Carolina Silveira; Merib, Josias de Oliveira
Este trabalho propõe, pela primeira vez, um método baseado em solvente de hidrofilicidade comutável (SHS) como fase extratora para determinação de cortisol e testosterona em amostras fluido oral por cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (HPLC-DAD).
Validação da Técnica de Amplificação Isotérmica de DNA Mediada por Loop (LAMP) em Isolados de Candida spp. e Nakaseomyces glabrata
(2023-08-29) Herter, Amanda; Mattevi, Vanessa Suñé; Schirmer, Helena
A prevalência das doenças invasivas causadas por fungos oportunistas tem aumentado nos últimos anos. Os fungos do gênero Candida são os principais agentes etiológicos, estando associados a taxas de mortalidade de até 70%. O diagnóstico da candidíase invasiva permanece difícil e demorado graças à utilização de métodos que exigem o isolamento do fungo em meio de cultura, impedindo o tratamento adequado no tempo certo. A técnica de LAMP se mostra uma alternativa promissora para o diagnóstico da infecção, por ser simples, rápida e de baixo custo. Este trabalho teve como objetivo investigar a viabilidade da utilização dessa metodologia na identificação de diferentes espécies de Candida e Nakaseomyces glabrata (Candida glabrata), analisando especificidade, sensibilidade e custoefetividade. Os isolados de Candida spp. e N. glabrata foram aquecidos a 65°C por 30 minutos com Chelex-100 para o isolamento do DNA e as reações de LAMP utilizaram primers com sequências-alvo nas regiões ITS2 e SAP1. A especificidade foi determinada pela inclusão de outras espécies de Candida e outros gêneros de fungos e a sensibilidade analítica foi estimada através de uma diluição em série de DNA. Foram realizados testes quanto ao desempenho da reação direto em matriz biológica (sangue em garrafa de hemocultura e em tubo de EDTA). Ainda, foi realizada a análise de custo-efetividade do LAMP, comparando o uso de kit comercial e da técnica in house. Os resultados de especificidade e sensibilidade analítica foram 100% e 100pg/μL, respectivamente. A sensibilidade diagnóstica variou entre 75% e 100% conforme a espécie e o tempo de reação. O LAMP direto em matriz biológica atingiu resultados satisfatórios no sangue em EDTA. A análise de custo-efetividade demonstrou que o uso do kit comercial é mais vantajoso devido ao menor tempo de resultado, maior facilidade de execução e menor risco de contaminação, apesar de a técnica in house apresentar o menor custo. A técnica de LAMP apresentou resultados promissores de especificidade e sensibilidade e se mostra um método com potencial para implementação em laboratórios pequenos e com poucos recursos.
Desenvolvimento de metodologia analítica baseada em microextração em fase líquida com solventes eutéticos profundos para a determinação de hormônios esteroides em urina
(2023) Andrade, Débora Coelho de; Merib, Josias de Oliveira
Amostras biológicas, como urina, constituem-se como matrizes complexas que podem ser utilizadas para a determinação de um significativo número de compostos de interesse clínico, toxicológico e forense. Dentre esses compostos estão os biomarcadores, ferramentas importantes para a detecção precoce de certas doenças. Devido à complexidade, as matrizes biológicas geralmente necessitam de um preparo antes da sua análise em instrumentos analíticos. Com esse intuito, técnicas como a extração líquido-líquido (LLE) e a extração em fase sólida (SPE) são empregadas no preparo dessas amostras. Porém, estas técnicas apresentam algumas desvantagens, principalmente em relação ao alto volume de solventes tóxicos utilizados. Desta forma, este trabalho abordou o desenvolvimento de um método analítico alternativo, baseado em microextração em fase líquida (LPME) e emprego de solventes eutéticos profundos (DES). Para isso, o DES foi preparado a partir de mentol e ácido decanóico, caracterizado através de espectroscopia no infravermelho, e utilizado em amostras de urina para a extração de hormônios esteroides, através da técnica de microextração líquido-líquido assistida por ultrassom (UALLME). Os parâmetros experimentais foram otimizados utilizando ferramentas multivariadas e univariadas, sendo que a melhor condição de extração consistiu em tempo de extração de 3 minutos em ultrassom, 150 μL de solvente extrator, DES contendo mentol:ácido decanóico na proporção 1:1 de razão molar e volume de amostra de 3 mL. As amostras de urina diluídas foram fortificadas com padrões analíticos dos analitos e extraídas com as condições otimizadas. O método apresentou limites de detecção (LOD)de 8 e 23 μg L-1, 97 a 119% em termos de recuperação e 5 a 14% em termos de desvio-padrão relativo. Com isso, observa-se que a metodologia analítica proposta e executada apresenta potencial para utilização em matriz biológica como a urina para a determinação dos hormônios estriol, 17-β-estradiol e estrona que podem ser utilizados como ferramenta auxiliar para detectar câncer. Com base em predições de dinâmica molecular, o trabalho tem como perspectiva o desenvolvimento de solventes com diferentes proporções visando maiores interações entre o solvente extrator e os hormônios, obtendo resultados com limites analíticos de detecção menores em amostras de urina.
Avaliação antibacteriana e antibiofilme associada a metabolômica para identificação de substâncias bioativas: um estudo sobre espécies de Combretum (Combretaceae)
(2021) Barros, Thayná Fernandes; Trentin, Danielle da Silva; Silva, Denise Brentan da
Espécies de Combretaceae têm sido utilizadas na medicina popular para tratar doenças inflamatórias e infecciosas, e diversos metabólitos secundários já foram descritos para algumas espécies do gênero Combretum. Infecções causadas por Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa são reconhecidas como desafios clínicos dado o grau de virulência dos mesmos e resistência a múltiplos antibacterianos. Neste sentido, a terapia antivirulência, que visa atenuar a virulência sem inibir o crescimento bacteriano, representa uma abordagem alternativa para controlar infecções bacterianas com menor pressão para o surgimento de populações resistentes. Dessa forma, a aplicação de técnicas metabolômicas e análises de dados têm se mostrado ferramentas atrativas para acelerar a descoberta de fármacos. Sendo assim, este estudo teve como objetivos avaliar a atividade antibacteriana e antibiofilme das espécies C. laxum, C. leprosum e C. lanceolatum frente a duas bactérias-padrão, e identificar, através do perfil metabólico e comprovação experimental, os fitocompostos bioativos. Folhas e cascas das três espécies foram coletadas na região do Pantanal, no estado do Mato Grosso do Sul, em 2016. O material vegetal foi submetido à extração acelerada por solvente e a composição química de cada extrato foi determinada por CLAE-DAD-EM. Os extratos foram avaliados frente à S. aureus ATCC 25904 e P. aeruginosa ATCC 27853 quanto à atividade antibacteriana, através da técnica de microdiluição em caldo, e atividade de inibição de biofilme, pela técnica de cristal violeta. Os extratos hidrometanólicos das três espécies apresentaram maior inibição da formação de biofilme de S. aureus sem inibir o crescimento, no entanto não foram ativos para P. aeruginosa. As análises de correlação de Pearson r sugeriram 35 metabólitos como possíveis substâncias responsáveis pela ação antibiofilme de S. aureus. Destas, 18 substâncias foram adquiridas comercialmente e avaliadas in vitro. Os flavonoides luteolina, miricetina e quercetina inibiram a formação de biofilme de S. aureus, porém o precursor de taninos hidrolisáveis, ácido elágico, foi a substância mais ativa inibindo 73% da formação de biofilme (5 μM) sem afetar o crescimento bacteriano. Não foram observadas interações sinérgicas entre as quatro substâncias ativas. Considerando que flavonoides glicosilados e açúcares simples apresentaram correlação positiva com a atividade antibiofilme de S. aureus, o efeito de açúcares sobre o crescimento e a virulência bacteriana foi aprofundado. Açúcares simples, identificados nas espécies Combretum, não foram ativos contra S. aureus e também não aumentaram a ação antibiofilme das quatro substâncias acima citadas. Em estudo de revisão da literatura observamos que, flavonoides glicosilados têm menor ação antibacteriana e antivirulência do que as respectivas agliconas frente a distintas bactérias. Esta dissertação evidenciou a aplicaçãoda metabolômica para o direcionamento de substância biotivas, conferindo agilidade e menor custo no processo de identificação de protótipos. As substâncias polares das espécies de Combretum demonstraram-se mais ativas na prevenção da formação de biofilme de S. aureus, dentre as quais destacamos o ácido elágico e a turicina para prosseguir em estudos futuros. Substâncias antibiofilme podem potencialmente ser utilizadas como coadjuvantes no tratamento de infecções e no desenvolvimento de superfícies menos propensas à adesão bacteriana, fundamental na redução de infecções associadas à dispositivos médicos.
Aplicação da nanotecnologia como ferramenta de drug delivery no estudo de terapias moleculares e farmacológicas para o câncer de pele
(2022) Ghisio, Estefany Carolina; Wink, Márcia Rosângela; Paese, Karina
O câncer de pele é um dos tipos de câncer mais comuns e os tipos mais frequentes são o carcinoma escamoso, o carcinoma basocelular e omelanoma. Esta patologia ocorre através de um crescimento anormal das células da pele e se detectada precocemente pode ser tratada de forma eficaz. Apesar da melhora nos desfechos dos pacientes, aumentando as taxas de sobrevida global, os tratamentos apresentam algumas particularidades, como respostas diferenciadas em diferentes tipos de tumor e aquisição de resistência ao tratamento pelo paciente e alguns efeitos adversos. Dessa forma, a nanotecnologia se apresenta como uma alternativa visando o aprimoramento dos tratamentos antitumorais. Esta abordagem pode aumentar a biodisponibilidade das moléculas terapêuticas em alvos específicos reduzindo os efeitos adversos do tratamento resultando em uma maior eficácia terapêutica. O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão na literatura acerca da utilização da nanotecnologia associada a diferentes terapias e aplicadas no câncer de pele. Além disso, esse trabalho teve como objetivo desenvolver uma nanopartícula polimérica de Eudragit® RS 100 com estabilidade eletrostática. Acerca da revisão de trabalhos que utilizaram a nanotecnologia como ferramente de drug delivery para tratamento de cancer depele, os resultados encontrados apresentaram resultados promissores de inibição da disseminacao tumoral, reducao de taxas de metastases e melhora na taxa de sobrevida global nos experimentos in vivo. Enquanto isso, no objetivo experimental dessa dissertação, obteve-se uma nanocápsula polimérica com resultados com características monomodais e homogêneas indicando um potencial veículo farmacológico promissor quando associado a novos agentes terapêuticos ou a dacarbazina, no entanto necessitando de maistestes para demonstrar seu potencial uso.
Efeito da dieta hiperlipídica e da suplementação com probiótico na expressão gênica no bulbo olfatório e na memória de camundongos machos adultos
(2023) Fraga, Brenda Santos; Giovenardi, Márcia; Feistauer, Vanessa
Nos mamíferos, o olfato afeta diretamente o consumo e a frequência de ingestão dos alimentos, uma vez que contribui para a avaliação hedônica dos alimentos. O bulbo olfatório (BO) é a estrutura cortical responsável pelo processamento de sinais químicos que entram na cavidade nasal e devido a suas projeções para o sistema límbico, possui papel importante nas funções fisiológicas, incluindo reprodução, comportamento social, localização e seleção de alimentos, além de regular funções neuroendócrinas. A suplementação com probióticos vêm sendo investigada pela sua potencial ação na redução de mediadores inflamatórios. Nosso objetivo foi avaliar a expressão de genes relacionados com o sistema dopaminérgico, neuroinflamação e a homeostase energética no BO, bem como parâmetros bioquímicos no soro e a memória de longa duração em machos alimentados com dieta hiperlipídica e suplementação de probióticos por 16 semanas. Foram utilizadas amostras de camundongos machos (n=36) da linhagem C57BL/6J provenientes do projeto “Análise de intervenções na dieta e suplementação com probiótico, em diferentes fases do desenvolvimento, através da avaliação de parâmetros comportamentais, bioquímicos, imunológicos e genéticos” (CEUA número 722/21), mantidos no biotério da UFCSPA. Machos com 21 dias de idade foram divididos em 4 grupos: controle (CONT, recebeu dieta padrão de biotério), controle + probiótico (CONT+PROB), hiperlipídica (HFD) e hiperlipídica + probiótico (HFD+PROB), todos com livre acesso à água. Utilizou-se uma nova preparação probiótica composta por Lacticaseibacillus rhamnosus LB1.5 que contém contagens viáveis de 1,3 x 108 ufc/mL, e que foi administrada 3 vezes na semana por gavagem. Aos 5 meses de idade foi realizado o teste de reconhecimento de objetos (ORT). Após o teste comportamental, os animais foram anestesiados e eutanasiados para coleta do material biológico. O BO foi coletado e avaliou-se a expressão gênica relativa dos seguintes genes: receptor da dopamina (Drd2), tirosina hidroxilase (Th), fator neurotrófico derivado do cérebro (Bdnf), sirtuína 1 (Sirt1) e receptor de prolactina (Prlr). No soro foi quantificada a concentração de glicose e triglicerídeos. Não houve diferença significativa na memória de longa duração, mensurada pelo ORT, entre os 4 grupos estudados (p>0,05). Em relação a expressão gênica, a expressão do Drd2 apresentou um efeito do probiótico, mas nenhuma diferença estatística no ps teste. Entretanto, analisamos o gene Th e encontramos interação entre os fatores, dieta e tratamento e efeito do probiótico. No teste de post hoc, verificamos que a expressão gênica relativa de Th era mais baixa no grupo HFD+PROB quando comparado ao grupo HFD (p<0.05). Na análise da expressão gênica de Sirt1, a ANOVA de duas vias mostrou interação entre os fatores, dieta e tratamento, onde a expressão de Sirt1 diminuiu significativamente no grupo HFD e no grupo CONT+PROB (p<0.01). Não encontramos diferenças na expressão gênica de Prlr e Bdnf, nem nos parâmetros bioquímicos analisados. Como conclusão, a dieta rica em gordura e suplementação probiótica utilizadas durante 16 semanas não alteram a memória de longo prazo, mas modulam a expressão gênica no bulbo olfatório de camundongos machos adultos.
Aprendizado de máquina e “software” open-source na elaboração de reconstruções tridimensionais para o estudo de neurônios humanos e seus espinhos dendríticos
(2022) Renner, Josué; Rasia Filho, Alberto Antonio
A descrição da estrutura tridimensional (3D) do corpo neuronal, da ramificação dendrítica e dos espinhos dendríticos dos neurônios é essencial para a compreensão de como ocorre o processamento de informações no sistema nervoso ao longo da filogenia, mormente à complexidade que existe no ser humano. Frequentemente, esses componentes da estrutura neuronal apresentam conformações espaciais múltiplas, tornando necessária a elaboração de reconstruções 3D digitais para estudos morfológicos mais detalhados e precisos. A elaboração dessas reconstruções é, no entanto, desafiadora devido às questões relacionadas com a disponibilidade de “software” e com a complexidade do tecido nervoso e dificuldades técnicas inerentes ao processamento histológico de amostras postmortem humanas. A presente dissertação de mestrado teve como objetivo aplicar e desenvolver procedimentos de reconstrução 3D a fim de estudar a forma de neurônios humanos e seus espinhos dendríticos impregnados pela técnica de Golgi sob microscopia óptica de campo claro. A partir de imagens de microscopia de luz capturadas sequencialmente ao longo do eixo espacial ‘z’, o “software” open-source Neuromantic foi utilizado para a elaboração de reconstruções 3D e obtenção de dados morfométricos dos corpos celulares e ramificações dendríticas dos neurônios de von Economo presentes no córtex cingulado anterior e de neurônios com corpo celular fusiforme no pré-cúneo humanos. Para o estudo da presença, distribuição, número e diferentes formas dos espinhos dendríticos desses neurônios, reconstruções 3D foram feitas com algoritmo computacional na plataforma comercial MATLAB® com imagens microscópicas de maior aumento. De modo a evitar o uso adicional de “software” comercial, por causa de altos custos impeditivos e menor acesso a todos os pesquisadores, o presente trabalho também objetivou desenvolver um método adicional, simples, acessível e confiável para a reconstrução 3D de espinhos dendríticos com “software” gratuito. Para isso, utilizou-se o “software” open-source ilastik, que emprega algoritmos de aprendizado supervisionado de máquina para a segmentação de imagens. Esse novo método foi aplicado para a composição de reconstruções 3D dos espinhos dendríticos de neurônios do núcleo cortical do complexo amigdaloide humano, mas pode ser utilizado a priori em diversas outras áreas nervosas igualmente. As ferramentas computacionais que permitiram a elaboração das reconstruções 3D geraram dados morfológicos imprescindíveis sobre a forma do soma, orientação espacial dos ramos dendríticos nos três eixos espaciais e da presença, distribuição, número e forma diversa dos espinhos dendríticos dos neurônios estudados. Neurônios corticais e subcorticais humanos (e de outros animais) podem ser reconstruídos para estudos ontogenéticos, filogenéticos e hodológicos em cada área de interesse e/ou tipo neuronal relevante bem como para a investigação de alterações morfológicas de estruturas neuronais em doenças neurológicas e psiquiátricas. Por utilizar “software” que estão gratuitamente disponíveis para download e uso, o presente trabalho disponibiliza como realizar tais estudos e viabiliza o desenvolvimento de pesquisas nas quais as reconstruções 3D neuronais tornam-se acessíveis, mesmo com poucos recursos disponíveis, com qualidade, relevância internacional e atualidade dos dados obtidos, contribuindo para o conhecimento humano na área da Morfologia e das Neurociências.
Investigação de metodologias alternativas para extração de ácidos nucleicos: microextração em gota única de RNA utilizando um líquido iônico magnético como fase extratora
(2023) Alves, Mônica Silva; Merib, Josias de Oliveira; Lopes, Paulo Guilherme Markus
As técnicas de análise molecular para a determinação de ácidos nucleicos vêm se destacando cada vez mais nos protocolos de pesquisa e diagnóstico. O sucesso dessas técnicas se deve ao seu alto nível de sensibilidade e especificidade que as tornam reprodutíveis e confiáveis. Ainda assim, para obter um diagnóstico de qualidade é necessário realizar cuidadosamente o preparo das amostras, incluindo a etapa da extração do analito. A extração de RNA é particularmente delicada por se tratar de uma biomolécula muito instável. A utilização de Líquidos Iônicos Magnéticos (MILs) em técnicas de preparo de amostras está sendo investigada como possível alternativa para a extração dessas biomoléculas, correspondendo a procedimentos de baixo custo, com menor toxicidade que alguns protocolos tradicionais, e que requerem significativamente menos etapas para realização. Este estudo teve por objetivo investigar a capacidade de extração do MIL [P66614] + [Ni(hfacac)3] - , sintetizado pelo grupo de pesquisa, na captura de RNA total. Para tanto, foram utilizadas amostras aquosas contendo RNA já isolado obtido através do hipotálamo de camundongos machos e posteriormente diluído a fim de obter a concentração desejada para os experimentos. Além disso, foi utilizada uma plataforma de extração para ampliar a frequência analítica. As medições analíticas foram realizadas através da reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (RT-qPCR). Os resultados indicam que o MIL foi capaz de extrair o RNA de soluções com concentrações tão baixas quanto 3 ng/μL, apresentando reprodutibilidade em 6 ng/μL. Resultados preliminares indicaram que o MIL não inibiu a amplificação na PCR e que tempos longos de extração podem acarretar back-extraction. Este foi o primeiro estudo a utilizar microextração em gota única (SDME) com MIL na extração de RNA. Futuros estudos ainda são necessários para avaliar a capacidade de extração desse MIL na presença de interferentes e em matrizes complexas.
Investigação de metodologias alternativas para a extração de ácidos nucleicos
(2022) Ferreira Neto, Luiz Carlos ; Merib, Josias de Oliveira; Trentin, Danielle da Silva
O presente trabalho teve como base a proposta da investigação de uma metodologia analítica alternativa para a extração de DNA. Como relatado em diversos estudos, a extração de DNA apresenta-se como um ponto crítico nas determinações dessa biomolécula em diversos tipos de amostras. Desta forma, a metodologia de extração baseada na microextração em gota única (SDME, (do inglês single drop microextraction) utilizando líquidos iônicos magnéticos (MILs, do inglês magnetic ionic liquids) como fase extratora foi proposta. Essa metodologia consiste em um procedimento experimental eficiente e ambientalmente correto de preparo de amostras, o qual apresenta baixo custo, consumo reduzido de solventes e simplicidade de aplicação. Assim, o objetivo deste estudo foi desenvolver uma metodologia alternativa e com alta frequência analítica para a extração de DNA baseada em microextração com a aplicação de líquidos iônicos magnéticos. Foram sintetizados e caracterizados os MILs de ([P6,6,6,14+ ][Mn(II)(hfacac)3 − ]), ([P6,6,6,14+ ][ Ni(II)(hfacac)3 − ]) e ([P6,6,6,14+ ][Co(II)(hfacac)3 − ]) e utilizados como solvente de extração na técnica SDME seguido por análise utilizando reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction) e eletroforese em gel. Além disso, um procedimento experimental no qual foram permitidas extrações simultâneas em várias amostras também foi proposto e avaliado. Em um primeiro momento, amostras aquosas fortificadas com quantidades conhecidas de DNA para verificar a viabilidade de extração. Após isso, foram realizadas extrações em amostras de saliva, sangue e urina sendo obtidos resultados bastante satisfatórios principalmente para as matrizes de sangue e saliva. O método desenvolvido se mostrou com alta frequência analítica e capaz de extrair DNA de amostras biológicas complexas. Adicionalmente, o método desenvolvido foi aplicado com sucesso na plataforma de extração projetada ao longo deste trabalho, ao passo que mostra um grande potencial para a investigações futuras em PCR em tempo real, bem como para o aprimoramento do aparato proposto.

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