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Item O papel multifacetado dos astrócitos associados ao tumor: análise da participação da sinalização adenosinérgica na progressão do glioblastoma(2024-03-21) Debom, Gabriela Nogueira; Braganhol, Elizandra; Programa de Pós-Graduação em BiociênciasO glioblastoma (GB) é o tumor cerebral primário de maior incidência entre os adultos, apresentando um prognóstico devastador com uma média de sobrevida de apenas 12 – 15 meses. O microambiente tumoral (TME) desempenha um papel crucial na agressividade do GB, principalmente no estabelecimento de imunossupressão e evasão imune. Os astrócitos reativos presentes no TME podem favorecer a proliferação e invasão das células tumorais, contribuindo para o estabelecimento e avanço do tumor. Além disso, a adenosina, produzida pela enzima CD73 e expressa tanto por células tumorais como pelas demais células do TME, tem um papel crucial na imunomodulação do TME, sendo a inibição da CD73 eficaz na redução do crescimento e da agressividade do tumor. Considerando isso, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar os efeitos da sinalização adenosinérgica no microambiente estabelecido pelo GB, principalmente relacionado à influência dos astrócitos associados ao tumor. O capítulo 1 da presente tese traz uma revisão na literatura científica sobre o tema, onde investigou-se o papel dos diversos marcadores purinérgicos (enzimas e receptores) nos diferentes fenótipos de astrócitos reativos, sugerindo a via adenosinérgica como um novo alvo para a otimização da eficiência terapêutica do tratamento para o GB. Subsequente a isso, no capítulo 2 foi avaliado o efeito da adenosina na resistência in vitro ao tratamento com exposição à radiação ionizante (RI), um dos pilares da terapia utilizada em pacientes com GB. Para tal, foram utilizadas 3 diferentes linhagens celulares de GB. Nossos resultados sugerem que as células expostas à radiação apresentaram níveis mais elevados de expressão de CD73 e atividade enzimática. Além disso, fomos capazes de observar um efeito relevante na taxa de crescimento das células de GB após a exposição à RI combinada com um inibidor farmacológico de CD73. Esses resultados evidenciaram um efeito promissor na inibição da produção de adenosina no TME para aumentar a eficácia da radioterapia. Por fim, no capítulo 3 da presente tese foi investigado o papel do TME do GB sobre a reatividade astrocitária e as consequências dessa modulação sobre a progressão tumoral. Foram utilizadas amostras primárias provenientes de um modelo animal de indução de GB para a análise por meio da ferramenta de Single cell RNA-seq. Os resultados mostraram que os astrócitos provenientes de amostras do tumor, ou seja, os chamados astrócitos associados ao tumor (TAA), possuem um perfil transcricional único, relacionado a importantes marcadores associados à ativação de vias inflamatórias, como a resposta celular frente ao lipopolissacarídeo e o recrutamento de células imunes. Além 13 disso, é demonstrado também que a interação entre células tumorais e astrócitos contribui diretamente para a reatividade dos astrócitos associados ao tumor, influenciando a imunomodulação do TME. Em suma, os dados obtidos nos três capítulos desta tese indicam que a via adenosinérgica apresenta-se com um potencial para ser um novo alvo na otimização da eficiência terapêutica do tratamento usualmente escolhido como padrão ouro para o GB, além de lançar uma visão promissora sobre o papel dos astrócitos reativos na fisiopatologia do GB.Item Aspectos moleculares e clínicos do sistema Rh em doadores de sangue e na Doença Hemolítica do Feto e do Recém-nascido(2024) Rodrigues, Mirelen Moura de Oliveira; Fiegenbaum, Marilu; Almeida, Silvana de; Programa de Pós-Graduação em BiociênciasIntrodução: O sistema Rh é um dos mais importantes sistemas de grupos sanguíneos, pois é considerado altamente imunogênico e polimórfico. Dois genes codificam os antígenos do sistema Rh, RHD e RHCE, sendo os mais importantes os antígenos D, C, c, E, e. O desenvolvimento de anticorpos contra antígenos do sistema Rh está associado a reações transfusionais hemolíticas imediatas e tardias e a Doença Hemolítica do Feto e do Recém-nascido (DHFN). No âmbito da imunohematologia, as técnicas de sequenciamento de DNA podem ser muito úteis para elucidar casos de discrepâncias entre genotipagem e fenotipagem e para identificação de novas variantes de grupos sanguíneos. Objetivos: Compreender as discrepâncias entre os resultados de genotipagem e fenotipagem para os antígenos C/c, E/e em amostras de doadores de sangue do Hospital de Clínicas de Porto Alegre utilizando o sequenciamento das regiões codificantes e adjacentes dos genes RHD e RHCE com discrepância, avaliando a presença de possíveis variantes que expliquem a discrepância. Devido à grande importância dos antígenos do sistema Rh no desenvolvimento da DHFN, a tese também tem como objetivo realizar uma busca sistemática na literatura sobre o tema DHFN e a frequência de anticorpos antieritrocitários em gestantes descrevendo mais prevalentes. Método: O presente estudo avaliou 395 amostras fenotipadas e genotipadas para os antígenos C/c e E/E de doadores de sangue do Hospital de Clínicas, dentre estas foram avaliadas quais amostras apresentaram discrepâncias entre genótipo e fenótipo para os alelos RHCE*e/*E (rs609320) e RHCE*c/*C (rs676785). A fenotipagem foi realizada utilizando a metodologia de tubo com antissoros monoclonais e a genotipagem através da técnica de PCR em tempo real utilizando sistema TaqMan®. As amostras discrepantes para os dois alelos foram sequenciadas utilizando 20 pares de primers para abranger as regiões codificantes e adjacentes dos éxons dos genes RHD e RHCE. As reações de sequenciamento foram realizadas pelo método Sanger. Também foi realizada uma busca sistemática na literatura sobre o desenvolvimento de DHFN e a presença aloimunização em gestantes. O estudo foi conduzido sob aprovação do CEP da UFCSPA (nº 2.753.780). Resultados: Dentre as 395 amostras avaliadas para as metodologias de genotipagem e fenotipagem, 15 apresentaram discrepância entre genótipo e fenótipo para os dois alelos investigados concomitantemente, em duas amostras a análise do sequenciamento confirmou o resultado obtido na genotipagem para o alelo RHCE*E/*e. Foram identificadas variantes, que possivelmente possam explicar as discrepâncias nestas amostras. Dentre as variantes encontradas, duas ainda não estão descritas. Utilizando ferramentas de análise in silico foi possível observar que as variantes podem apresentar potencial de causar alterações na expressão da proteína RhCE e, consequentemente, na expressão dos alelos. A variante encontrada no éxon 6 do gene RHCE foi classificada como “provável dano” utilizando o software PolyPhen-2 com score de 0,999 (sensibilidade = 0,99) e classificada como “tolerada” pelo software SIFT. A segunda nova variante descrita, localizada no final do íntron 7 do gene RHCE, utilizando o software RegulomeDB foi obtido um score de 1,0 o que significa que a nova variante pode alterar a ligação e à expressão gênica. A partir da busca sistemática sobre DHFN e aloimunização, revisamos 75 artigos publicados, ao total 13.966 gestantes apresentavam aloimunização. Os anticorpos mais prevalentes neste estudo de revisão do sistema foram, anti-D (35,01%), anti-K (14,69%), anti-E (11,21%), anti-c (5,48%), anti-C (4,93%) e anti-M (2,35%). Conclusão: Embora o genótipo seja preditor do fenótipo, há algumas situações em que expressão gênica é alterada, como por exemplo, no sistema Rh a presença de antígenos fracos e parciais. Nosso estudo contribui com a identificação de novas variantes que possivelmente podem ter influência na expressão da proteína RhCE. Em relação a DHFN, embora o anti-D ainda seja o anticorpo mais frequente associado a DHFN, podemos observar que outros anticorpos contra antígenos dos sistemas Rh, Kell e MNS apresentam grande prevalência, principalmente, o anti-K e anti-E. Sendo assim, há a necessidade de atentar para a DHFN com o entendimento de que outros anticorpos contra antígenos de grupos sanguíneos estão associados ao desencadeamento da doença implicando em anemia com implicação leve a grave e inclusive no óbito do feto ou recém-nascido e de que é necessário identificar e acompanhar a gestantes com risco de incompatibilidade materno fetal.Item Hábitos alimentares, estilo de vida e estado mental durante a pandemia de COVID-19 e o efeito da suplementação de zinco em mulheres com sobrepeso ou obesidade(2023-10-26) Vargas, Liziane da Silva de; Guedes, Renata Padilha; Peres, Alessandra; Programa de Pós-Graduação em BiociênciasNos últimos anos, houve um aumento na prevalência e incidência de obesidade, atingindo proporções epidemiológicas preocupantes. Notavelmente, a obesidade representa um sério desafio para a saúde pública em todo o mundo, e esse cenário pode ter se agravado ainda mais após a pandemia de COVID-19. A obesidade é uma doença de origem multifatorial, neurocomportamental, progressiva e recidivante, embora seja tratável. É caracterizada pelo excesso anormal de tecido adiposo, o qual aumenta a suscetibilidade a doenças crônicas não transmissíveis e também afeta a estrutura e a função cerebral. Diante deste contexto, é essencial investigar estratégias adjuvantes para o tratamento da obesidade. O zinco (Zn) é um mineral com importantes funções metabólicas que pode modular o comprometimento neurológico relacionado à obesidade. Assim, a presente tese teve dois enfoques principais: 1 - Investigar as mudanças nos hábitos alimentares, estilo de vida e cognição durante a pandemia de COVID-19 e 2 - Avaliar os efeitos de doze semanas de suplementação de Zn no perfil inflamatório, função cognitiva e estado mental de mulheres com sobrepeso ou obesidade por meio de um estudo randomizado, duplo-cego e controlado por placebo. A primeira parte deste estudo foi conduzida por meio de uma pesquisa on-line realizada em dois momentos distintos: no início da pandemia por COVID-19 (em 2020) e durante o segundo ano de pandemia (em 2021). Os resultados revelaram que ao longo do período pandêmico, tanto no início quanto no segundo ano, houve um impacto adverso nos hábitos alimentares e no modo de vida da população gaúcha. Esse impacto foi associado ao aumento de peso e ao aumento do risco de comprometimento cognitivo. A segunda parte desta tese, foi realizada por meio de um estudo randomizado, onde participaram mulheres com idade entre 40 e 60 anos, as quais foram divididas aleatoriamente em dois grupos, suplementação (recebendo 30 mg de Zn/dia) ou placebo durante 12 semanas. Dados sociodemográficos, antropométricos, dietéticos, atividade física, função cognitiva, estado emocional foram coletados juntamente com amostras de saliva no início e no final do estudo. A avaliação cognitiva consistiu no Mini Exame do Estado Mental (MEEM), Teste de Fluência Verbal, Teste do Desenho do Relógio e Teste de Stroop. Os sintomas de ansiedade e depressão foram avaliados por meio dos instrumentos escala de Beck e BDI-II, respectivamente. Amostras de saliva foram coletadas para análise de IL-1β, IL-6, TNF-α, insulina, nitrito e zinco. Os participantes foram instruídos a não mudar seus hábitos alimentares durante a participação no estudo. Das 42 participantes (média de idade 49,58 ± 6,46 anos), 32 foram incluídos nas análises do estudo. As alterações no peso corporal, IMC e macronutrientes não foram significativamente diferentes entre os grupos placebo versus suplementação (p > 0,05). As pontuações cognitivas nos testes MEEM e Stroop foram significativamente melhores no grupo de suplementação em comparação com o grupo de placebo (p < 0,05, p = 0,13), respectivamente. Doze semanas de suplementação com Zn foi capaz de melhorar os escores cognitivos avaliados pelo teste MEEM e Stroop em mulheres com sobrepeso ou obesidade, independentemente da perda de peso corporal. Esses resultados sugerem que a suplementação de Zn pode ser considerada uma estratégia adjuvante para a prevenção dos prejuízos cognitivos associados à obesidade.Item Avaliação da eficácia de uma nanoemulsão de temozolomida e da influência de co e pré-tratamentos com ferroceno em linhagens celulares de glioblastoma humano(2023-11-08) Henn, Jeferson Gustavo; Moura, Dinara JaquelineO glioblastoma é um glioma de grau IV, ocorrendo predominantemente em adultos e com características altamente agressivas. O tratamento convencional para este tipo tumoral compreende ressecção cirúrgica, seguida de radioterapia combinada com quimioterapia utilizando temozolomida. Estas abordagens terapêuticas desempenham um papel essencial na gestão clínica da doença, embora ainda resultem em um prognóstico desfavorável, com uma média de sobrevida global de apenas 14 a 19 meses. Isto ocorre principalmente devido à natureza inoperável da maioria dos tumores e à resistência crescente à quimioterapia quando estes são diagnosticados em estágios avançados, o que justifica a necessidade pela busca de novas moléculas e estratégias terapêuticas para o seu tratamento. O recente progresso na área da nanotecnologia, com o desenvolvimento de sistemas de entrega de fármacos como as nanoemulsões, e a ação sensibilizante tumoral e geradora de espécies reativas de oxigênio do ferroceno, têm trazido novas possibilidades à complementação da quimioterapia em diversos tipos de câncer, aumentando a eficácia dos tratamentos. Neste contexto, esta tese apresenta dois capítulos abordando (i) as diferentes nanoestruturas já desenvolvidas para a entrega de moléculas no tratamento do câncer, como estas conseguem atingir o ambiente tumoral e aumentar a toxicidade nos tecidos-alvo, e as barreiras que estes sistemas enfrentam para alcançar resultados positivos, bem como (ii) o desenvolvimento, a caracterização e a avaliação da citotoxicidade de uma nanoemulsão contendo temozolomida e sua combinação com ferroceno em linhagens celulares de glioblastoma humano. A caracterização físico-química da nanoemulsão revelou a presença da temozolomida na interface do sistema, permitindo sua rápida liberação. Em combinação com o ferroceno, reduziram a viabilidade celular em tratamentos agudos e em regime de dois ciclos, aumentando a sensibilidade à temozolomida da linhagem celular T98G por meio da alteração do potencial da membrana mitocondrial, com uma indução de espécies reativas de oxigênio, com consequente morte celular. Estes resultados demonstraram a eficácia do uso de uma nanoemulsão contendo temozolomida e sua combinação com ferroceno como uma efetiva abordagem ao tratamento do glioblastoma. Além disso, o rápido desenvolvimento da nanomedicina e o constante melhoramento das técnicas relacionadas apontam para um futuro promissor no tratamento de diversos tipos de câncer com um possível aumento da qualidade de vida destes pacientesItem Efeitos da suplementação de ômega-3 sobre a microbiota intestinal, aspectos metabólicos e neurofuncionais em ratos obesos alimentados com dieta de cafeteria(2022-06-29) Pereira Neto, João; Guedes, Renata Padilha; Moreira, José Claudio FonsecaDevido ao número crescente de indivíduos obesos, a obesidade tem sido considerada uma verdadeira epidemia mundial, tornando-se um sério problema de saúde pública. A obesidade ocasiona diversas alterações metabólicas, predispondo a secreção crônica de moléculas pró-inflamatórias. Desta forma, a presente tese de doutorado teve como objetivo avaliar o efeito da suplementação de ômega-3 sobre a microbiota intestinal, parâmetros metabólicos e neurofuncionais em ratos machos obesos alimentados com dieta de cafeteria. A dieta foi administrada por 20 semanas, sendo que na 16ª semana, os animais iniciaram a suplementação de ômega-3 por gavagem (500 mg/Kg/dia). Na 20ª semana, os animais foram submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado e de memória social, e após foram eutanasiados. Amostras de sangue foram coletadas para as determinações dos níveis de glicose, triglicerídeos, insulina, citocinas e ácidos graxos de cadeia curta e LPS. O SNC foi coletado para as dosagens de citocinas, ácidos graxos saturados e expressão de claudina-5 e TLR-4. O intestino e as fezes do ceco também foram coletados para a avaliar a morfologia do intestino e a composição da microbiota intestinal. Nossos resultados demonstraram que a suplementação de ômega-3 diminuiu IL-6 no fígado. No cérebro, diminuiu o TNF-α, porém aumentou os níveis de ácidos graxos saturados (caprílico, palmítico, esteárico, tricosanóico e lignocérico), assim como o ácido miristoleico, que é insaturado, e o ácido linoleico, que é poliinsaturado. Na microbiota, aumentou a razão Firmicutes/Bacteroidetes. No plasma, reduziu os níveis de butirato, isobutirato e LPS. Quanto ao comportamento, o ômega-3 diminuiu o comportamento do tipo ansioso nos ratos obesos. A CAF aumentou peso corporal, adiposidade visceral, e os níveis de glicose, insulina e triglicerídeos. Além disso, aumentou o ácido palmítico, a expressão de TLR-4 no córtex cerebral e diminuiu claudina-5 no hipocampo. Os animais alimentados com CAF também apresentaram maior interação social sem efeito do n-3. Desta forma, concluímos que a CAF é um modelo efetivo para provocar obesidade severa, com piora dos parâmetros metabólicos e diminuição da diversidade da microbiota intestinal. Embora, inesperadamente, melhorou a interação social entre os animais. O ômega-3 apresentou limitações para reverter os efeitos nocivos provocados pela exposição crônica a CAF. No entanto, os benefícios em reverter a endotoxemia, parâmetros neuroinflamatórios e melhora do comportamento ansioso, colocam o ômega-3 como uma alternativa a ser considerada para o tratamento destas condições.Item Atividade antimicrobiana e antivirulência de compostos provenientes de fonte natural(2021) Rossatto, Fernanda Cristina Possamai ; Zimmer, Karine Rigon ; d’Azevedo, Pedro AlvesO resíduo do processamento da uva representa uma fonte importante de compostos renováveis, cuja atividade biológica permanece pouco estudada. Estes resíduos são produzidos em grandes quantidades, podendo causar danos ambientais. Neste sentido, a busca por compostos bioativos com propriedades antimicrobianas e antivirulência nesta matéria-prima é uma alternativa interessante. Uma série de metabolitos secundários – como os compostos fenólicos – são produzidos pela uva, exercendo funções protetivas contra agentes patogênicos. Eles são estratégias promissoras em virtude de sua diversidade estrutural e amplo espectro de propriedades biológicas. Em paralelo, há uma necessidade urgente por novas opções terapêuticas para o controle de infecções causadas por bactérias e fungos, principalmente infecções associadas a biofilmes, as quais são de difícil controle e tratamento. Por estas razões, o presente trabalho teve como objetivo principal a busca por estratégias antimicrobianas e antivirulência – com foco na pesquisa antibiofilme – no controle de infecções bacterianas e fúngicas. Numa primeira etapa, foi investigado o potencial de extratos e frações provenientes do resíduo da uva no controle de biofilmes bacterianos. Para este objetivo, três variedades de resíduos da uva foram coletadas: a uva branca Chardonnay (Vitis vinifera) e as uvas tintas Cabernet Franc (Vitis vinifera) e Bordô (Vitis labrusca). Extração assistida por ultrassom foi conduzida de forma exaustiva com diclorometano, metanol e água. Quatro modelos bacterianos foram utilizados: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa. A atividade antimicrobiana foi mensurada pela obtenção da concentração inibitória mínima (CIM) e por meio da leitura da OD620nm. Possível efeito sinérgico foi verificado através de combinações entre os extratos e antimicrobianos convencionais. A atividade antibiofilme dos extratos a 5 mg/mL foi avaliada através da metodologia do cristal violeta. Os extratos apresentaram valor de CIM entre 1,25 mg/mL e 5 mg/mL contra os microrganismos testados e observou-se efeito sinérgico entre o extrato aquoso da uva Cabernet Franc e o antimicrobiano oxacilina, e extrato aquoso da uva Chardonnay e vancomicina contra os modelos Gram-positivos. O resíduo da uva Chardonnay extraído com diclorometano apresentou os melhores resultados para todas bactérias testadas, inibindo a formação do biofilme sem inibir o crescimento bacteriano. Este extrato foi submetido à cromatografia em coluna de fase normal. Duas frações apresentaram atividade antibiofilme, prevenindo a adesão de S. aureus e S. epidermidis à superfície de poliestireno em 80% a 0,62 mg/mL e inibindo o biofilme de K. pneumoniae em 25% a 0,31 mg/mL. As frações e extratos foram analisados por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (UHPLC-ESI- MS/MS) e indicaram a presença de ácidos graxos, polifenois, alcaloides e aminoácidos. Além disso, a toxicidade dos extratos foi avaliada em modelo invertebrado de Caenorhabditis elegans, demonstrando que os mesmos não afetaram a sobrevivência, tamanho e progenia do nematoide. Numa segunda etapa, os polifenóis ácido elágico (AE) e ácido cafeico fenetil éster (CAPE) foram avaliados quanto às suas atividades antifúngicas contra Candida spp. Para este propósito, os compostos puros foram adquiridos comercialmente e tiveram a atividade antifúngica contra C. albicans SC5314 e um painel de 10 isolados de Candida auris multirresistentes avaliada por microdiluição em caldo e por ensaio do time-kill. AE e CAPE apresentaram valores de CIM ≤ 0,5 μg/mL e entre 1 a 64 μg/mL, respectivamente. AE apresentou efeito fungistático e CAPE fungicida para ambas as espécies de Candida. O mecanismo de ação dos compostos foi investigado pelo ensaio de proteção do sorbitol e pelo ensaio de ligação ao ergosterol, indicando provável ação sobre a parede celular fúngica. CAPE foi capaz de inibir a produção de fosfolipases, biofilmes e filamentação, além de inibir a adesão de C. albicans ou C. auris a células epiteliais do pulmão. AE e CAPE não foram tóxicos a hemácias em todas concentrações testadas (até 64 μg/mL), nem ao modelo in vivo de Galleria mellonella (até 128 mg/kg). Quando G. mellonella foi pré-tratada com AE ou CAPE (32 mg/kg) antes da infecção por C. albicans ou C. auris, a taxa de sobrevivência da larva foi significativamente prolongada, com uma taxa de sobrevivência de 44% para ambos os compostos. Além disso, AE, a 4 μg/mL, prolongou em 40% a sobrevivência do nematoide C. elegans infectado com C. albicans. Em conjunto, estes resultados demonstram o potencial antibacteriano e antifúngico de metabólitos secundários de fonte natural, dentre eles, extratos e frações provenientes do resíduo da uva, e compostos da classe dos polifenóis. Em conclusão, compostos de origem natural representam uma fonte promissora de moléculas antimicrobianas e antivirulência. O desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos a partir destas fontes enseja amenizar a problemática da resistência antimicrobiana e da escassez de opções terapêuticas para o controle de infecções.Item Avaliação da variabilidade genética de selenoproteínas na suscetibilidade ao carcinoma hepatocelular(2021) Alves, Andressa de Freitas; Almeida, Silvana de; Fiegenbaum, Marilu; Giovenardi, MárciaIntrodução: O carcinoma hepatocelular é uma neoplasia primária do fígado, classificada como a terceira causa de morte por câncer no mundo. Qualquer condição que leve a uma doença hepática crônica, configura-se como um agente oncogênico em potencial. O estresse oxidativo é uma das condições estudadas devido à ligação entre o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e danos ao DNA. As selenoproteínas, por sua vez, desempenham papel antioxidante no corpo, combatendo esse efeito. Alterações na estrutura e/ou expressão dessas proteínas podem estar ligadas à suscetibilidade do organismo aos efeitos do estresse oxidativo, incluindo a carcinogênese. Objetivo: Avaliar a influência da variabilidade genética e da expressão das selenoproteínas na suscetibilidade ao carcinoma hepatocelular. Metodologia: Foram realizados dois estudos. No primeiro estudo foi avaliada a expressão gênica de enzimas antioxidantes (GPX1, GPX4, SEP15, SelP, SOD1, SOD2, GSR, CAT e NRF2) em tecidos tumorais e não tumorais de pacientes com CHC, além de pacientes saudáveis. As análises foram realizadas experimentalmente por RT-qPCR em pacientes com carcinoma hepatocelular e por bioinformática em pacientes dos bancos de dados TCGA e GTEx. No segundo estudo foi realizada a genotipagem por qPCR dos SNPs GPX1 rs1050450, GPX1 rs3448, GPX4 rs713041, SEP15 rs5845, SEP15 rs5859, SELENOP rs7579 e SELENOP rs3877899 em pacientes caso e controle, assim como foi realizada em pacientes do TCGA por ferramentas de bioinformática. As taxas de perda de heterozigosidade estimada foram calculadas pelo pacote de R HWE-LOH. Ambos os estudos foram aprovados pelo CEP da UFCSPA (no 2.400.119 e no 2.315.844). Resultados: As análises de bioinformática detectaram diferença significativa entre os grupos caso x controle e tumor x peritumor na expressão de grande parte dos genes estudados. Em comparação ao tecido peritumoral, a expressão de GPX4 estava aumentada (p=0,02) e a de SOD2 diminuída (p=0,04) no tecido tumoral nos dados experimentais. A baixa expressão de GPX1 (p=0,006), GPX4 (p=0,01), SELENOP (p=0,006), SOD1 (p=0,007), CAT (p<0,001), e NFE2L2 (p<0,001), e alta expressão de GSR (p<0,001), foram associados com menor sobrevida em 12 meses nos pacientes do TCGA. Além disso, foram encontradas diferenças significativas nas frequências genotípicas de todos os SNPs estudados, exceto para o rs3448, entre casos e controles (p<0.05), na amostra experimental. Tanto a amostra experimental quanto os dados do TCGA apresentaram tendência a perda do genótipo heterozigoto em amostras tumorais, sendo que as análises de perda heterozigosidade estimada revelaram taxas variadas (8-41%) nas mesmas amostras. A perda de heterozigosidade para o SNP rs713041 do gene GPX4 foi associada com características clínico-patológicas como a etiologia (consumo de álcool, p=0,04) e o grau histológico (tumores pouco diferenciados, p=0,02). Conclusões: Tanto alterações na expressão gênica quanto nos genes de selenoproteínas parecem ter papel importante no desenvolvimento e progressão do carcinoma hepatocelular.Item Sistemas poliméricos de entrega de substâncias: do aumento da eficácia do processo de cicatrização a aplicações oncológicas(Wagner Wessfll, 2022) Reinhardt, Luiza Steffens; Moura, Dinara JaquelineOs sistemas de entrega de fármacos são uma área de estudo relativamente nova, mas em rápido desenvolvimento, que descreve como materiais biocompatíveis são empregados para servir como meio de ferramenta de diagnóstico e/ou para fornecer agentes terapêuticos a tecidos de maneira controlada. Essa tecnologia oferece múltiplos benefícios no tratamento de doenças humanas crônicas como a entrega específica e controlada de fármacos ao tecido alvo. Neste contexto, esta tese apresenta uma série de capítulos de livro sobre os avanços em sistemas poliméricos de entrega de substâncias em que formulações, tanto provenientes de fontes sintéticas como naturais, foram aplicadas para o tratamento do câncer ou para proteger feridas e/ou acelerar o processo de cicatrização. Ainda, formulações contendo o poli(álcool vinílico) foram produzidas pela técnica de eletrofiação, caracterizadas em relação ao tamanho, morfologia, estabilidade e liberação de fármacos, e testadas in vitro e in vivo, incluindo (i) formulações contendo um extrato padronizado de Plantago australis, as quais demonstraram significante potencial terapêutico acelerando o processo de cicatrização, e (ii) microfibras poliméricas contendo um inibidor da proteína Nek1 e temozolomida para o tratamento in situ de glioblastomas, um tipo de câncer cerebral muito agressivo. As microfibras contendo o co-tratamento foram capazes de melhorar significantivamente a eficácia do tratamento em modelo animal pré-clínico, aumentando a sobrevida e diminuindo o volume tumoral de quando comparado à quimioterapia tradicional. Ademais, as oportunidades e os desafios de sistemas de entrega de substâncias utilizadas no tratamento e diagnóstico concomitante de doenças complexas foram revisados e discutidos em um capítulo de livro. Foi possível concluir que sistemas de entrega de substâncias são ferramentas promissoras para aprimorar a eficácia de terapias.Item Efeito da deleção de Nek1 em células de glioblastoma(Wagner Wessfll, 2021) Morás, Ana Moira; Moura, Dinara Jaqueline; Lenz, GuidoOs glioblastomas (GBM) são gliomas de classe IV altamente prevalentes dentre os tumores malignos do SNC. Após diagnóstico, apenas 4 a 5% dos pacientes sobrevivem mais de 5 anos, e apesar de todo o progresso recente nas estratégias de tratamento, a sobrevida média é de cerca de 15 meses. A terapia padrão de GBM consiste em máxima ressecção cirúrgica, seguida por radioterapia e quimioterapia à base de temozolomida. Essa tríade de ação é fundamental para o manejo clínico da doença e aumento da qualidade de vida do paciente, porém, o GBM permanece como uma doença incurável. Por esse motivo, compreender como os processos de resistência tumoral são regulados pode auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. A proteína Nek1 pertence à família de cinases relacionadas à NIMA (NEK) e possui importantes funções na resposta a danos no DNA e checkpoint de ciclo celular. Sua participação na resposta a danos no DNA ocorre principalmente nas etapas iniciais de sinalização, através do eixo NEK1>ATR>Chk1. A proteína Nek1 é uma das proteínas que já foi associada com resistência tumoral em células de gliomas. Para uma melhor compreensão do cenário clínico no qual o GBM está inserido de forma a revisar o estado da arte das estratégias de tratamento, bem como novos alvos terapêuticos realizou-se um trabalho de revisão. Esse trabalho mostrou que a utilização de estratégias farmacológicas para inibir proteínas de resposta a danos no DNA em glioblastoma falham principalmente devido à baixa tolerabilidade dessas terapias. A fim de superar essas características negativas, grande atenção foi dada para o campo de estratégias no sistema de entregas, associadas a abordagens neurológicas para tratamento local, aumentando assim a biodisponibilidade e a eficiência dos medicamentos. Desta forma, o papel da proteína Nek1 na resposta a danos no DNA em glioblastoma foi investigado no segundo trabalho, apresentado nesta tese. Nós mostramos que células deficientes em Nek1 aumentam a sensibilidade a danos induzidos por zeocina, tanto num tratamento agudo, quanto crônico. As respostas celulares, por sua vez, difeririam nesses dois esquemas de tratamentos. O tratamento agudo induziu maior ativação de H2AX, Chk2 e p53 em células deficientes em Nek1. O perfil de ciclo celular, neste esquema de tratamento, foi semelhante à linhagem selvagem, com uma parada em G2. Em uma exposição crônica, por outro lado, as células deficientes em Nek1 demonstraram menor ativação de H2AX e redução na % de células com parada de ciclo celular de em G2, em relação à linhagem selvagem. Por fim, nós também analisamos o perfil de expressão de Nek1 em biopsias de pacientes com diagnóstico de Glioblastoma confirmado. Nossos resultados indicam que os níveis de Nek1 variam de baixa a alta expressão e não se correlacionam com Ki67. Dessa forma, esse artigo indica que Nek1 é um alvo interessante na resposta a agentes radiomiméticos, uma vez que impactou na resposta celular, porém sua relevância ainda precisa ser melhor explorada.Item Enterococcus spp. associados a animais marinhos selvagens: genômica comparativa, filogenômica e identificação de moléculas bioativas(Wagner Wessfll, 2020) Prichula, Janira; Seixas, Adriana; d’Azevedo, Pedro Alves; Frazzon, Ana Paula GuedesOs estudos genômicos têm contribuído muito para o entendimento da virulência, da biologia e da evolução das bactérias do gênero Enterococcus. Todavia, o foco tem sido amplamente direcionado às análises comparativas de genomas de linhagens clínicas relevantes, havendo poucos trabalhos sobre enterococos de ecologias selvagens. Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivo realizar uma caracterização em nível genômico de Enterococcus spp. recuperados da microbiota de aves, répteis e mamíferos marinhos selvagens encontrados na costa sul do Brasil. Bibliotecas de DNA genômico de 27 Enterococcus spp. isolados de 17 animais marinhos foram preparadas, e o sequenciamento do genoma foi realizado usando-se a Plataforma Illumina MiSeq e HiSeq. Primeiramente, foi realizado um estudo com as linhagens de Enterococcus spp. provenientes de pinguins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus) e outro estudo relacionando as linhagens provenientes de diferentes aves (Spheniscus magellanicus e Sterna trudeaui), répteis (Chelonia mydas e Eretmochelys imbricata) e mamíferos marinhos (Arctocephalus australis, Grampus griseus e Balaenoptera acutorostrata). Os estudos avaliaram a diversidade genética e a presença de elementos associados ao sucesso de colonização e plasticidade genômica. Foram investigados genes de resistência, virulência, CRISPRs, plasmídeos e genes que codificam moléculas bioativas. Os resultados, obtidos por meio de análises filogenômicas e de genômica comparativa, demonstraram que os enterococos de animais marinhos selvagens apresentam poucos determinantes relacionados à virulência, não estando intimamente relacionados com linhagens clínicas. Algumas espécies de enterococos podem, inclusive, servir como bioindicadores do ecossistema marinho e de impactos antrópicos. Além disso, enterococos associados às espécies marinhas se mostraram uma fonte importante de novos compostos para aplicação biotecnológica. Foi encontrado um número expressivo de agrupamentos de genes relacionados a moléculas antimicrobianas, sendo os mais abundantes os que codificam bacteriocinas, seguidos pelos envolvidos em rotas de síntese de terpenos e de peptídeos não ribossomais (NRPS). Trinta diferentes bacteriocinas pertencentes a diferentes classes foram descritas, incluindo oito novas moléculas com potencial bioativo a ser investigado. A caracterização em nível genômico possibilitou, também, a identificação de dois isolados, um pertencente à espécie E. avium e outro da espécie E. mundtii, com potencial probiótico. Dessa forma, o grande número de informações geradas por este trabalho pode ser explorado em vários aspectos, incluindo desde propósitos ambientais, ecológicos e evolutivos até biotecnológicos, como a identificação de potenciais linhagens probióticas e a elucidação de novos compostos bioativos.Item Investigação de variantes em genes envolvidos no metabolismo do tecido adiposo com o desenvolvimento de lipodistrofia e avaliação da técnica DBS no monitoramento terapêutico de fármacos em pessoas vivendo com HIV em terapia antirretroviral(2019) Tagliari, Carmela Farias da Silva; Mattevi, Vanessa Suñé; Linden, RafaelO vírus da imunodeficiência humana (HIV) infecta, principalmente, linfócitos T helper (T auxiliar) que expressam a proteína de superfície CD4 (LT-CD4+) causando o enfraquecimento do sistema imunológico e favorecendo o aparecimento de doenças oportunistas. Na ocorrência dessa situação, a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) se desenvolve. A prevalência de pessoas vivendo com HIV (PVHIV) continua a crescer mundialmente. Contudo, novas infecções pelo vírus crescem de forma particular em determinadas regiões do mundo. A terapia antirretroviral (TARV) combinada mudou a perspectiva da infecção pelo HIV de uma doença mortal para uma enfermidade crônica. Apesar destes benefícios, alguns pacientes não atingem a supressão viral. Sabe-se que os fármacos antirretrovirais (ARVs) são capazes de atuar em nível molecular, alterando a atividade de fatores de transcrição em genes do metabolismo glicídico e lipídico, induzindo dislipidemia, resistência à insulina (RI), diabetes mellitus (DM) e síndrome metabólica (SM), além dos efeitos na fisiologia dos adipócitos. Estes últimos favorecem o desenvolvimento da síndrome da lipodistrofia (LD). Diversos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) em genes do metabolismo glicídico e lipídico já foram implicados na susceptibilidade à LD e SM, sendo de especial interesse o fator de necrose tumoral (TNF), o receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama (PPARG), o fator de transcrição de ligação ao elemento regulatório de esterol 1 (SREBF1), o gene associado a obesidade e massa gorda (FTO) e a sirtuína 1 (SIRT1). Em conjunto ao monitoramento da carga viral, as PVHIV em TARV também requerem o acompanhamento dos níveis circulantes dos fármacos a fim de assegurar o sucesso terapêutico e evitar níveis sub-terapêuticos, o que aumenta a chance de falha virológica. Uma alternativa minimamente invasiva para dosagem plasmática dos fármacos é a técnica de mancha de sangue seco em papel (DBS). Esta técnica possui inúmeras vantagens em relação ao procedimento padrão, dado que apresenta facilidade na coleta, transporte, armazenamento e, principalmente, a acessibilidade em regiões remotas. Desta forma, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a contribuição de SNPs nos genes supracitados como fatores de susceptibilidade ao desenvolvimento de LD em PVHIV. Ainda, determinar a os níveis plasmáticos dos fármacos antirretrovirais efavirenz (EFV) e atazanavir (ATV) através do método DBS e avaliar a exequibilidade desta ferramenta para o monitoramento terapêutico de fármacos (MTF) em uma amostra de indivíduos infectados pelo HIV sob TARV vivendo na região Sul do Brasil. Em nossa amostra (N = 832), identificamos que a prevalência de LD foi maior em indivíduos de raça branca do que em não brancos. A variante de risco A no SNP rs9939609 (T > A) do gene FTO e o alelo polimórfico G para o SNP rs2297508 (C > G) no gene SREBF1 contribuíram para o desenvolvimento de LD (P = 0,006 e P = 0,052, respectivamente), mas não para SM (dados não mostrados). Não encontramos associação significativa entre os polimorfismos rs2273773 T>C, rs12413112 G>A, rs7895833 A>G e rs12049646 T>C no gene da SIRT1 e o risco de desenvolvimento de LD (P = 0,949, P = 0,841, P = 0,797 and P = 0,700, respectivamente) e SM (dados não mostrados). As quantificações dos fármacos EFV e ATV foram altamente correlacionadas entre o método DBS e o plasma. Assim, a técnica DBS pode ser uma alternativa ao método padrão. Contudo, a burocracia e o sistema logístico brasileiro precisa ser superado para que a técnica DBS seja uma realidade no cuidado clínico das PVHIV.Item Sistema dopaminérgico e dieta: uma investigação de variantes genéticas em humanos e expressão gênica em roedores(2019) Feistauer, Vanessa; Almeida, Silvana de; Giovenardi, MárciaA ingesta de alimentos ricos em gordura e açúcar, tanto em humanos quanto em animais, aumenta drasticamente a síntese e secreção de dopamina em áreas do sistema de recompensa. Em humanos, essa sensação de recompensa após a ingestão alimentar, é particular e mais intensa em alguns indivíduos, em comparação a outros. Variantes genéticas, portanto, principalmente em genes do sistema dopaminérgico, podem influenciar na resposta de diferentes pessoas expostas aos mesmos fatores ambientais. Para investigarmos a relação do sistema dopaminérgico com a ingesta alimentar e como a dieta pode alterar esse sistema, dois tipos de estudo foram utilizados. Inicialmente, em uma coorte de crianças acompanhadas desde o nascimento, investigamos a associação de variantes no gene ANKK1/DRD2 com padrões de ingestão alimentar e parâmetros de adiposidade. O alelo *A1 da variante TaqIA (rs1800497) foi relacionada com o aumento da ingestão alimentar de lipídeos em crianças de 7-8 anos, mas o polimorfismo -141C Ins/Del (rs1799732) não foi associado a nenhuma das variáveis analisadas. Em modelo animal, as dietas restritiva e hipercalórica modificaram a expressão gênica na área tegmentar ventral (ATV) e no hipotálamo (HPT) de genitoras e de sua prole. Na ATV, ambas as dietas foram relacionadas a uma elevação nos níveis de mRNA dos genes Th, Drd1, Drd2 e Drd3, no entanto, o gene Slc6a3/Dat1 teve sua expressão aumentada apenas nas fêmeas que receberam a dieta hipercalórica. Na prole dessas fêmeas, observamos, pelo contrário, uma redução generalizada na expressão gênica Th, Ddc, Drd2, Drd3 e Slc6a3/Dat1, devido a interação entre a dieta materna e a dieta da prole. Já no HPT, demonstramos que a alteração na expressão gênica ocasionada pela dieta foi mais expressiva nas genitoras. As dietas restritiva e hipercalórica elevaram os níveis de mRNA dos genes Drd1, Drd3, Maoa e Th, mas apenas as fêmeas que receberam dieta hipercalórica tiveram expressão aumentada de Comt e Ddc. Em contrapartida, as dietas reduziram a expressão do gene Drd4. A expressão gênica da prole foi menos alterada pela dieta nessa área, uma vez que a interação entre a dieta materna e a dieta materna foi relacionada com a redução dos níveis de mRNA apoenas do gene Maob. A dieta da prole aumentou a expressão do gene Drd3, e reduziu a expressão de Comt. Através dos dados apresentados, observa-se a importância do sistema dopaminérgico e sua relação com a alimentação, tanto em humanos quanto em camundongos. Variantes em genes relacionados ao sistema dopaminérgico podem modificar a transmissão dopaminérgica, provocando maior ou menor sensação de recompensa após a ingestão alimentar, e ocasionando desfechos como sobrepeso e obesidade. Além disso, alterações na expressão de genes do sistema dopaminérgico podem ser ocasionadas tanto pela alimentação materna durante a gestação e a lactação, quanto pela alimentação na vida adulta.