Avaliação da toxicidade da bilirrubina e dos ácidos biliares em células renais cultivadas

Abstract

Contextualização: A síndrome hepatorrenal é definida pela presença de lesão renal aguda secundária à lesão hepática. Novos insights sugerem que fatores tubulotóxicos não hemodinâmicos, como endotoxinas (bilirrubina) e ácidos biliares (ABs), podem mediar a lesão renal do parênquima. Em geral, a presença de um maior número de partículas urinárias (células epiteliais tubulares renais e cilindros granulares) de origem renal pode ser observada nos grupos com hiperbilirrubinemia/hiperbilirrubinúria e lesão tubular. Já se sabe também da nefrotoxicidade que alguns fármacos podem apresentar, como a cisplatina que é utilizada contra turmores sólidos, porém pode induzir à injúria nos túbulos renais. Objetivo: Avaliar a citotoxicidade e o potencial antioxidante da bilirrubina e ABs em cultura de células renais HEK293T, o tipo de morte celular e o potencial protetor desses compostos frente a outros compostos nefrotóxicos. Metodologia: A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de vermelho neutro, o estresse oxidativo foi analisado por meio da marcação mitocondrial com mitosox e mitostatus, o tipo de morte celular foi avaliado utilizando a marcação com anexina e iodeto de propídio e a concentração do tratamento intracelular e no meio de cultura de bilirrubina e ABs foi determinada por HPLC. Resultados: O tratamento agudo (24h) com bilirrubina reduziu a viabilidade celular, mas apresentou maior viabilidade com 100 µM (96 ± 8%, p <0,0001) e apresentou maior toxicidade no tratamento crônico (72h) com 100 µM (25,6 ± 5,6; p <0,001). ABs primários (ácido cólico - CA e quenodeoxicólico - CDCA) induzem menor toxicidade a 40 µM (CA: 150 ± 33,7%, p <0,005 CDCA: 281 ± 143%, p <0,0001) em comparação com ABs secundários e compostos (ácido desoxicólico - DCA, ursodeoxicólico - UDCA e taurocólico - TCA) a 60 µM (DCA: 87 ± 8%, p <0,001; UDCA 86 ± 8%, p <0,001; TCA 95 ± 23%, p <0,001), em 24h. Já nas concentrações maiores, 80 µM e 100 µM, os ácidos não mostraram diminuir a viabilidade celular. O tratamento celular com bilirrubina ou ABs, prévio à cisplatina (10µg), induziu aumento da viabilidade celular com CA (133 ± 62%; p <0,005), em relação ao controle positivo, indicando efeito protetor; no entanto, as células tratadas com os outros ABs e bilirrubina também mostraram viabilidade positiva (CDCA: 110 ± 61%, p = 0,01; TDCA: 99 ± 63%, p <0,005; BILI: 88 ± 27 %, p <0,005). Quando quantificados por HPLC, bilirrubina e ABs apresentaram maior concentração no meio de cultura do que nas células (tratamento 24h). Nem a bilirrubina nem os ABs mostraram produção de estresse oxidativo, em comparação ao controle positivo (células tratadas com cisplatina). O tratamento celular com bilirrubina apresentou maior quantidade de morte celular por necrose (83 ± 3%; p <0,05), enquanto os ácidos biliares não demonstraram grande morte celular significante. Conclusão: a bilirrubina mostrou maior ação tóxica em células HEK293T, quando comparada aos ABs. A morte celular por necrose é um fator que contribui para o desenvolvimento de lesão renal aguda em doenças hepáticas, principalmente na exposição crônica a este composto e se relaciona aos achados observados no sedimento urinário, em estudos prévios. Dependendo da estrutura dos ABs, eles podem ter ação protetora sobre as células renais, assim como a concentração de bilirrubina, que nos tratamentos agudos tem se mostrado protetora para as células e no tratamento crônico, mostrou-se tóxica.