Navegando por Autor "Lopes, Paulo Guilherme Markus"

Agora exibindo 1 - 2 de 2
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Desenvolvimento de ensaios de PCR em tempo real para identificação de quatro subespécies do complexo Streptococcus bovis/Streptococcus equinus a partir de swab retal
    (2013) Lopes, Paulo Guilherme Markus; d'Azevedo, Pedro Alves
    O complexo Streptococcus bovis/Streptococcus equinus (SBEC) abrange espécies patogênicas relacionadas em diferentes níveis com infecções em humanos. Este complexo de genoespécies tem sido associado a desordens hepatobiliares e mais notavelmente em adenomas de cólon e câncer colorretal (CCR). Portanto, o objetivo deste estudo foi desenvolver ensaios de PCR em tempo real (qPCR), utilizando o sistema TaqMan®-MGB e baseado nos genes recN e gyrB, para detecção de S. gallolyticus subsp. gallolyticus, S. gallolyticus subsp. pasteurianus, S. infantarius subsp. coli e S. infantarius subsp. infantarius, e quantificação de S. gallolyticus sp. a partir de amostras de swab retal de voluntários sob risco para doenças gastrintestinais. Estes ensaios foram testados em cinco isolados clínicos e 14 cepas referência de Streptococcus sp., Enterococcus sp. e Escherichia coli. Os cinco isolados clínicos e quatro cepas referência foram corretamente identificadas, nenhum falso-positivo foi observado entre as cepas de Streptococcus sp. filogeneticamente relacionadas, igualmente para as outras espécies testadas O ensaio quantitativo pode detectar valores acima de 30 cópias genômicas bacterianas. Foram incluídos no estudo 54 (H=19, média etária 64,6, entre 46-76 e M=35, média etária 57,9, entre 44-80, P=0,015) voluntários ambulatoriais e não colostomizados submetidos à colonoscopia. A prevalência geral das subespécies do SBEC esteve em 35,2%: S. gallolyticus subsp. gallolyticus (11,1%), S. gallolyticus subsp. pasteurianus (13%), S. infantarius subsp. coli (20,4%) e S. infantarius subsp. infantarius (11,1%). Nosso estudo demonstrou associações entre doença hemorroidária (P=0,047) e litíase biliar (P=0,023) com colonização por ao menos uma subespécie do SBEC. Litíase biliar também esteve relacionada com colonização por S. infantarius subsp. coli (P=0,021) e doença hepática crônica com colonização S. infantarius subsp. infantarius (P=0,002). Estes ensaios de qPCR estabelecem condições para detecção molecular das subespécies do SBEC bem como quantificar S. gallolyticus sp. a partir de amostras coletadas por swab retal e podem ser utilizados para triagem e vigilância em pacientes submetidos à colonoscopia.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Investigação de metodologias alternativas para extração de ácidos nucleicos: microextração em gota única de RNA utilizando um líquido iônico magnético como fase extratora
    (2023) Alves, Mônica Silva; Merib, Josias de Oliveira; Lopes, Paulo Guilherme Markus
    As técnicas de análise molecular para a determinação de ácidos nucleicos vêm se destacando cada vez mais nos protocolos de pesquisa e diagnóstico. O sucesso dessas técnicas se deve ao seu alto nível de sensibilidade e especificidade que as tornam reprodutíveis e confiáveis. Ainda assim, para obter um diagnóstico de qualidade é necessário realizar cuidadosamente o preparo das amostras, incluindo a etapa da extração do analito. A extração de RNA é particularmente delicada por se tratar de uma biomolécula muito instável. A utilização de Líquidos Iônicos Magnéticos (MILs) em técnicas de preparo de amostras está sendo investigada como possível alternativa para a extração dessas biomoléculas, correspondendo a procedimentos de baixo custo, com menor toxicidade que alguns protocolos tradicionais, e que requerem significativamente menos etapas para realização. Este estudo teve por objetivo investigar a capacidade de extração do MIL [P66614] + [Ni(hfacac)3] - , sintetizado pelo grupo de pesquisa, na captura de RNA total. Para tanto, foram utilizadas amostras aquosas contendo RNA já isolado obtido através do hipotálamo de camundongos machos e posteriormente diluído a fim de obter a concentração desejada para os experimentos. Além disso, foi utilizada uma plataforma de extração para ampliar a frequência analítica. As medições analíticas foram realizadas através da reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (RT-qPCR). Os resultados indicam que o MIL foi capaz de extrair o RNA de soluções com concentrações tão baixas quanto 3 ng/μL, apresentando reprodutibilidade em 6 ng/μL. Resultados preliminares indicaram que o MIL não inibiu a amplificação na PCR e que tempos longos de extração podem acarretar back-extraction. Este foi o primeiro estudo a utilizar microextração em gota única (SDME) com MIL na extração de RNA. Futuros estudos ainda são necessários para avaliar a capacidade de extração desse MIL na presença de interferentes e em matrizes complexas.