Programa de Pós-Graduação em Biociências

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Navegando Programa de Pós-Graduação em Biociências por Autor "Bonorino, Cristina Beatriz Cazabuena"

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    Desenvolvimento de um ensaio para detecção de anticorpos de bloqueio dos receptores inibitórios imunes PD-1/PD-L1 por citometria de fluxo
    (2025-06-27) Pscheidt, Veridiane Maria; Bonorino, Cristina Beatriz Cazabuena; Gassen, Rodrigo Benedetti; Programa de Pós-Graduação em Biociências
    A imunoterapia com anticorpos monoclonais que bloqueiam receptores inibitórios imunes como a proteína de morte celular programada 1 (PD-1) e seu ligante (PD-L1) revolucionou o tratamento do câncer. O desenvolvimento de novas terapias e biossimilares exige metodologias analíticas validadas para caracterizar a capacidade de bloqueio funcional desses anticorpos. Embora a citometria de fluxo seja uma plataforma versátil, poucos ensaios são descritos para esta aplicação específica. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um ensaio de citometria de fluxo para quantificar a capacidade de bloqueio da interação PD-1/PD-L1. Para isso, foi desenvolvido um ensaio onde a proteína recombinante PD-1 humana foi conjugada a beads de poliestireno. A capacidade de bloqueio foi medida pela inibição da ligação da proteína PD-L1 conjugada a um fluorocromo, às esferas com PD1. O ensaio demonstrou inibição dose dependente na presença de um anticorpo monoclonal αPD-L1. A partir da curva de inibição, construída com concentrações no intervalo de 0,1 a 15 µg/mL, foi determinado um IC₅₀ médio de 3,122 µg/mL. A plataforma se mostrou precisa e robusta, sem diferença estatisticamente significativa entre três ensaios independentes (ANOVA de duas vias, p = 0,2178). Adicionalmente, a atividade de bloqueio foi validada em um ensaio funcional de co-cultura, no qual o anticorpo αPD-L1 restaurou significativamente a ativação de células T (p = 0,0001). Conclui-se que o ensaio desenvolvido é uma ferramenta precisa, reprodutível e rápida, adequada para a triagem funcional e o controle de qualidade de novos anticorpos monoclonais direcionados ao eixo PD-1/PD-L1.
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    O Papel da ubiquitina ligase Marchf1 durante o desenvolvimento de células dendríticas e na geração da resposta imune antitumoral
    (2024-10-11) Lima, Karina Rodrigues; Bonorino, Cristina Beatriz Cazabuena; Borges, Thiago de Jesus; Programa de Pós-Graduação em Biociências
    Marchf ligases são enzimas da família das ubiquitina ligases E3, responsáveis por ubiquitinar proteínas e direcioná-las para a degradação pelo proteassomo. Marchf1 ubiquitina as moléculas MHC II e CD86, responsáveis pelos sinais 1 e 2 de ativação de células T naive pelas células apresentadoras de antígeno (APCs), como células dendríticas (DCs). Marchf1 tem um papel importante na regulação de respostas em modelos de asma e transplante, no entanto seu papel na regulação da resposta imune durante o crescimento tumoral ainda é desconhecido. Neste trabalho, investigamos o papel da Marchf1 nos modelos tumorais murinos de melanoma B16-OVA e adenocarcinoma de cólon MC38, usando animais geneticamente deficientes em Marchf1 (Marchf1 -/- ). Observamos que a ausência de Marchf1 tanto no hospedeiro como especificamente em DCs (animais CD11cCreMarchf1fl/fl) resultou em um maior crescimento tumoral nos dois modelos. Isso foi acompanhado por uma redução da resposta específica de células T CD8+ e de DCs convencionais do tipo 1 (cDC1s) no microambiente tumoral e em tecidos linfoides secundários. A resposta desses animais à imunoterapia com anticorpos anti-PD1 e antiCTLA-4 também ficou diminuída. Uma investigação mais aprofundada revelou que a falta de Marchf1 nas cDC1s não altera sua capacidade de apresentar antígenos a células T específicas, nem resulta em diminuição da sua sobrevivência nos tecidos em comparação com os animais controle. Contudo, ao analisar o desenvolvimento das DCs em animais Marchf1-/- , foi possível observar um menor número de precursores das cDCs (pré-cDCs) na medula óssea e nos tecidos linfoides secundários. O tratamento dos animais com a citocina Ftl3L resultou na restauração do controle do crescimento tumoral semelhante aos animais controles, bem como na recuperação da resposta T CD8+ efetora e de níveis normais de cDC1s. Nossos resultados indicam que o desenvolvimento normal de precursores de DCs na medula óssea, bem como a infiltração de cDC1s no microambiente tumoral é dependente de mecanismos que necessitam da expressão da ubiquitina ligase Marchf1 em DCs. E que ao menos alguns desses mecanismos podem ser restaurados com o tratamento com Ftl3L. Além do mais, observamos resultados similares em outro modelo dependente de células T CD8+, o modelo de transplante de coração. Portanto, podemos concluir que Marchf1 é necessária para a indução de uma resposta imune efetora funcional.