Programa de Pós-Graduação em Biociências
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Navegando Programa de Pós-Graduação em Biociências por Autor "Bertoni, Ana Paula Santin"
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Item Análise da sinalização purinérgica em células epidermais humanas após exposição à radiação ultravioleta(2021) Nunes, Walquíria Souza; Wink, Márcia Rosângela; Bertoni, Ana Paula SantinA exposição cutânea à radiação ultravioleta (RUV) é um efeito ambiental inerente à vida humana. Já foi observado, em estudos in vitro, que essa exposição induz a liberação de ATP de células epidermais, principalmente em queratinócitos. O ATP é fundamental para a célula, pois fornece a energia livre de que essas células necessitam para realizar suas atividades. Entretanto, sua presença no espaço extracelular possibilita seu desempenho como molécula de sinalização intercelular. Essa comunicação ocorre através de nucleotídeos e nucleosídeos, dos receptores (divididos em família P1 e P2), bem como das ectonucleotidases que atuam hidrolisando os ligantes, regulando assim a sua disponibilidade. Todos esses componentes formam a sinalização purinérgica, sendo esse sistema envolvido em vários processos patofisiológicos cutâneos. Assim, nosso objetivo foi avaliar se a exposição à radiação ultravioleta é capaz de modular componentes da sinalização purinérgica. Para isso, foi realizada uma revisão sistemática e uma análise in silico para verificação da modulação de purinoreceptores e ectoenzimas após a exposição à RUV. Ademais, foi realizado experimentos de bancada com o intuito de avaliar a atividade enzimática em células Hacat após exposição à UVA e UVB. Os resultados oriundos da revisão sistemática apontam que o ATP é rapidamente liberado de células epidermais, queratinócitos e melanócitos, após a exposição a RUV (1-10 minutos); essa molécula age como um mediador pró-inflamatório induzindo a liberação de IL-1β, IL-6 e COX-2 de queratinócitos e, somado ao caráter inflamatório, o ATP possui um papel na melanogênese e esse processo parece ser dependente do receptor P2X7. As análises in silico não indicam modulação em nenhum elemento da sinalização purinérgica (purinoreceptores ou ectonucleotidases) em melanócitos após a exposição única à RUV nas condições investigadas. Por outro lado, queratinócitos irradiados apresentam um aumento na expressão gênica de P2X4, P2Y11 e P2Y13, e diminuição na expressão de P2Y2. Além disso, as análises in silico indicam aumento nos níveis dos genes ENPP1 e ENTPD4, além de sugerir diminuição nos níveis de ENTPD6. A partir dos resultados experimentais, não foi observado modulação no gene NT5E, que codifica CD73, após única exposição à radiação ultravioleta em queratinócitos. Queratinócitos imortalizados expostos à 3 e 6J/cm2 não apresentam modulação na expressão de NT5E quando comparados ao grupo controle. Esses resultados sugerem o envolvimento da sinalização purinérgica na sinalização parácrina entre o melanócito e o queratinócito após à radiação ultravioleta. Uma melhor compreensão dessa modulação poderá contribuir para um entendimento mais profundo de diversas alterações cutâneas, bem como auxiliar na compreensão de processos fisiológicos, como a pigmentação. Esse conhecimento poderá ser utilizado tanto para uma melhor condução de tratamentos dermatológicos, quanto para elaboração de produtos na indústria farmacêutica voltados para a área estética.Item Mesenchymal stem cells derived extracellular vesicles for COVID-19 treatment(2024-05-29) Schultz, Iago Carvalho; Wink, Márcia Rosangela; Bertoni, Ana Paula Santin; Boilard, Eric; Programa de Pós-Graduação em BiociênciasA Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), causada pelo SARS-CoV-2, é uma doença sistêmica caracterizada por uma inflamação maciça e um desequilíbrio do sistema imunológico. Apesar dos esforços globais, o acesso a vacinas e tratamentos antivirais continua desigual. Portanto, terapias complementares de múltiplos alvos facilitariam o manejo dos pacientes. As células-tronco mesenquimais (CTMs) são conhecidas pelo seu potencial imunomodulador através da liberação de proteínas e outras moléculas no espaço extracelular, seja como elementos solúveis ou transportados por vesículas extracelulares (VEs). As VEs surgiram como uma opção terapêutica devido às suas propriedades intrínsecas, como o diâmetro nanométrico, e o seu conteúdo heterogêneo, incluindo pequenas sequências não codificantes envolvidas na repressão ou degradação de genes pós-transcricionais, como os microRNAs. O principal objetivo deste doutorado foi avaliar se as VEs das CTMs poderiam desempenhar um papel terapêutico durante o desenvolvimento da COVID-19. Primeiramente, através de análise bioinformática, analisamos quatro conjuntos de dados de miRNA utilizando diferentes fontes de tecido de células-tronco (medula óssea, cordão umbilical e tecido adiposo) e cruzamos seu conteúdo. Cinquenta e oito miRNAs se sobrepuseram nos quatro conjuntos de dados de miRNA analisados. Sequencialmente, esses miRNAs presentes em pelo menos dois conjuntos de dados foram submetidos ao software miRWalk, que previu 258, 267 e 148 miRNAs direcionados ao 3'UTR de citocinas e quimiocinas, genes de morte celular e cascatas de coagulação, respectivamente. Sequencialmente, para validar os achados in silico, obtivemos CTMs de tecido adiposo humano e avaliamos in vitro o potencial antiinflamatório de suas VEs durante a infecção por SARS-CoV-2. As VEs das CTMs foram isoladas dos sobrenadantes de culturas celulares utilizando centrifugação diferencial seguida de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e caracterizadas por citometria de fluxo, Análise de Rastreamento de Nanopartículas e imunoblotting. A microscopia confocal confirmou que as VEs das CTMs foram internalizadas pela linha celular alveolar, A549-hACE2, e se localizaram ao longo da via endocítica. Para determinar sua funcionalidade, as células A549-hACE2 foram infectadas com SARS-CoV-2 e tratadas com 3, 10, 30, 100 e 300 VEs das CTMs/célula por 24 horas, e os sobrenadantes das culturas celulares foram coletados. A análise multiplex de 30 VEs das CTMs/célula foi suficiente para alterar 32 de 48 mediadores imunológicos. Entre estes, MCP-1, IL-6 e IL8 foram confirmados por ELISA, resultando em uma redução dependente da dose. Além disso, a atividade antiviral das VEs das CTMs foi avaliada. Concentrações mais baixas (3, 10 e 30 VEs das CTMs/célula) não tiveram efeito na redução da replicação viral, embora concentrações mais altas (100 e 300 VEs/célula) mostraram reduções significativas.