Efeitos da vitrificação de complexos cumulus-oócito imaturos de Rattus norvegicus utilizando diferentes concentrações de crioprotetores e tempos de exposição sobre a maturação nuclear e desenvolvimento embrionário
| dc.contributor.advisor | Oliveira, Alexandre Tavares Duarte de | pt_BR |
| dc.contributor.author | Paim, Lia Mara Gomes | |
| dc.date.accessioned | 2016-07-07T19:16:01Z | |
| dc.date.accessioned | 2023-10-09T13:59:16Z | |
| dc.date.available | 2016-07-07T19:16:01Z | |
| dc.date.available | 2023-10-09T13:59:16Z | |
| dc.date.date-insert | 2016-07-07 | |
| dc.date.issued | 2015 | |
| dc.description | Dissertação (Mestrado)-Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre. | pt_BR |
| dc.description.abstract | Oócitos mamíferos submetidos a vitrificação ainda apresentam baixa viabilidade após a criopreservação. Consequentemente, os resultados de desenvolvimento embrionário subsequente são pouco expressivos se comparados com a vitrificação de embriões. Por esses motivos, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da associação de dois agentes crioprotetores usados na vitrificação de Complexos Cumulus-Oócito (CCOs) imaturos de Rattus norvegicus em diferentes concentrações e períodos de exposição sobre as taxas de retomada de meiose, maturação nuclear e desenvolvimento embrionário. Fêmeas pré-púberes Wistar foram superovuladas com 20 UI de eCG IP e eutanasiadas após 48 horas. Os ovários foram retirados da cavidade abdominal e mantidos em PBSm à 37°C até o momento da escarificação para liberação dos CCOs. A observação e a seleção morfológica dos CCOs foram realizadas com auxílio de estereomicroscópio. No primeiro experimento, os CCOs selecionados foram expostos a soluções de equilíbrio contendo diferentes concentrações de EG e DMSO diluídos em PBSm por 4 minutos. Após esse período, os CCOs foram expostos por 60 segundos a soluções crioprotetoras de acordo com os grupos: G1 - 2,7 M EG + 1,92 M DMSO; G2 - 3,6 M EG+ 1,28 M DMSO; G3 - 4,5 M EG + 0,64 M DMSO; e G4 - 5,4 M EG; adicionadas de 0,5 M de sacarose e 0,025 M de ácido hialurônico diluídos em PBSm. O grupo controle não foi exposto às soluções crioprotetoras. Após a exposição, os CCOs foram transferidos para placas com meio de maturação por 30 horas. Ao final da MIV, os CCOs foram desnudados e corados com Hoechst para avaliação das taxas de retomada de meiose e maturação nuclear. As soluções de equilíbrio e crioprotetora usadas no G4 foram utilizadas nos experimentos seguintes. No segundo experimento, os CCOs foram expostos à solução de equilíbrio por 4 minutos e à solução crioprotetora por 30, 60 ou 90 segundos, sendo imediatamente imersos em N2. O grupo controle não foi vitrificado. Após 7 dias vitrificados, os CCOs foram reaquecidos e maturados in vitro por 30 horas. As taxas de retomada de meiose e maturação nuclear foram avaliadas após o período de maturação. No terceiro experimento, os CCOs foram vitrificados com o tempo de exposição à solução crioprotetora de 60 segundos. O grupo controle não foi vitrificado. Após 7 dias vitrificados, os CCOs foram reaquecidos, maturados in vitro e ativados partenogeneticamente. Taxas de clivagem, mórula e blastocistos foram observadas durante 5 dias. No primeiro experimento, o grupo controle apresentou taxas de retomada de meiose (76,3%) e maturação nuclear (50%) superiores às obtidas nos grupos expostos as soluções crioprotetoras. No mesmo experimento, o G1 apresentou taxas de retomada de meiose (48,6%) e maturação nuclear (21,6%) inferiores quando comparado aos outros grupos expostos. No segundo experimento, o grupo controle apresentou taxas de retomada de meiose (79,6%) e maturação nuclear (36,3%) superiores em relação aos grupos vitrificados. Entretanto, dentre os grupos vitrificados, não houve diferença estatística. No terceiro experimento, as taxas de clivagem (65,3%) e mórula (38,8%) do grupo controle foram superiores em relação ao grupo vitrificado (14,5 % e 1,8 %, respectivamente). Entretanto, as taxas de blastocistos foram similares no grupo vitrificado e no grupo controle. Os resultados obtidos a partir dos nossos experimentos mostraram que a exposição à etilenoglicol e dimetilsulfóxido, em associação e em determinadas concentrações, pode ser tóxica para CCOs de Rattus norvegicus e prejudicar a maturação nuclear e o desenvolvimento embrionário posteriores. Portanto, são necessários mais experimentos para determinar condições adequadas para vitrificação de CCOs de Rattus norvegicus. | pt_BR |
| dc.description.abstract-en | Generally, mammalian oocytes exposed to vitrification present low viability after warming. Consequentely, subsequent embryo development rates are also low compared to embryo vitrification. Hence, the aim of this study was to assess the effects of the association of two cryoprotectants used for Rattus norvegicus immature Cumulus-Oocyte Complexes (COCs) vitrification using different concentrations and exposure periods on meiosis resumption, nuclear maturation and embryo development rates. Female prepuberal Wistar rats were superovulated by 20 IU eCG IP injection and euthanized after 48 hours. Ovaries were then immediately removed from the abdominal cavity and maintained at 37˚C in mPBS upon ovarian slicing. Further COC morphological selection was performed under stereomicroscope. In the first experiment, COCs were exposed to equilibrium solutions containing different concentrations of EG and DMSO diluted in mPBS for 4 minutes. After exposure, COCs were exposed to cryoprotective solutions for 60 seconds as the following groups: G1 - 2.7M EG + 1.92M DMSO; G2 - 3.6M EG + 1.28M DMSO; G3 - 4.5M EG + 0.64M DMSO; and G4 - 5.4M EG; added to 0.5M sucrose and 0.025M hyaluronic acid diluted in mPBS. Control group was not exposed to either the solutions. After exposure, COCs were transferred to maturation medium for 30 hours. At the end of MIV, COCs were denuded and stained with Hoechst to assess meiosis resumption and nuclear maturation status. Equilibrium and cryoprotective solutions correspondent to G4 were used for further experiments. In the second experiment, COCs were exposed to equilibrium solution for 4 minutes and to cryoprotective solution for 30, 60 or 90 seconds and immediately plunged into N2. Control group was not vitrified. After 7 days, COCs were warmed and in vitro matured for 30h. Meiosis resumption and nuclear maturation rates were assessed after 30h maturation. Finally, in the third experiment, COCs were vitrified using 60 seconds exposure period. Control group was not vitrified. After 7 days, COCs were warmed, in vitro matured for 30h and parthenogenetically activated. Cleavage, morula and blastocyst formation were observed throughout 5 days of embryo culture. In the first experiment, 8 control group presented higher meiosis resumption (76.3%) and nuclear maturation (50%) rates compared to the groups exposed to equilibrium and cryoprotective solutions. Moreover, G1 presented lower meiosis resumption (48.6%) and nuclear maturation (21.6%) rates compared to G2, G3 and G4. In the second experiment, control group presented higher meiosis resumption (79.6%) and nuclear maturation (36.3%) rates compared to the vitrified groups. However, there were no significant differences among the vitrified groups. In the third experiment, cleavage (65.3%) and morula (38.8%) rates were higher in the control group compared to the vitrified group (14.5% and 1.8%, respectively). However blastocyst rates were similar between the control and vitrified groups. Our data shows that the use of EG alone as a cryoprotective agent provides better MR and NM rates and considerable cleavage and morula rates. However, more research is necessary in order to elucidate more suitable conditions for Rattus norvegicus COC vitrification. | en |
| dc.identifier.uri | https://repositorio.ufcspa.edu.br/handle/123456789/162 | |
| dc.language.iso | other | pt_BR |
| dc.relation.requires | Adobe Reader | pt_BR |
| dc.rights | Acesso Aberto Imediato | * |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ | * |
| dc.subject | Vitrificação | pt_BR |
| dc.subject | Crioprotetores | pt_BR |
| dc.subject | Oócitos | pt_BR |
| dc.subject | Ratos | pt_BR |
| dc.subject | Embriões | pt_BR |
| dc.subject | [en] Vitrification | en |
| dc.subject | [en] Cryoprotective Agents | en |
| dc.subject | [en] Oocytes | en |
| dc.subject | [en] Rats | en |
| dc.subject | [en] Embryonic Structures | en |
| dc.title | Efeitos da vitrificação de complexos cumulus-oócito imaturos de Rattus norvegicus utilizando diferentes concentrações de crioprotetores e tempos de exposição sobre a maturação nuclear e desenvolvimento embrionário | pt_BR |
| dc.type | Dissertação | pt_BR |