Efeitos da vitrificação de complexos cumulus-oócito imaturos de Rattus norvegicus utilizando diferentes concentrações de crioprotetores e tempos de exposição sobre a maturação nuclear e desenvolvimento embrionário

Abstract

Oócitos mamíferos submetidos a vitrificação ainda apresentam baixa viabilidade após a criopreservação. Consequentemente, os resultados de desenvolvimento embrionário subsequente são pouco expressivos se comparados com a vitrificação de embriões. Por esses motivos, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da associação de dois agentes crioprotetores usados na vitrificação de Complexos Cumulus-Oócito (CCOs) imaturos de Rattus norvegicus em diferentes concentrações e períodos de exposição sobre as taxas de retomada de meiose, maturação nuclear e desenvolvimento embrionário. Fêmeas pré-púberes Wistar foram superovuladas com 20 UI de eCG IP e eutanasiadas após 48 horas. Os ovários foram retirados da cavidade abdominal e mantidos em PBSm à 37°C até o momento da escarificação para liberação dos CCOs. A observação e a seleção morfológica dos CCOs foram realizadas com auxílio de estereomicroscópio. No primeiro experimento, os CCOs selecionados foram expostos a soluções de equilíbrio contendo diferentes concentrações de EG e DMSO diluídos em PBSm por 4 minutos. Após esse período, os CCOs foram expostos por 60 segundos a soluções crioprotetoras de acordo com os grupos: G1 - 2,7 M EG + 1,92 M DMSO; G2 - 3,6 M EG+ 1,28 M DMSO; G3 - 4,5 M EG + 0,64 M DMSO; e G4 - 5,4 M EG; adicionadas de 0,5 M de sacarose e 0,025 M de ácido hialurônico diluídos em PBSm. O grupo controle não foi exposto às soluções crioprotetoras. Após a exposição, os CCOs foram transferidos para placas com meio de maturação por 30 horas. Ao final da MIV, os CCOs foram desnudados e corados com Hoechst para avaliação das taxas de retomada de meiose e maturação nuclear. As soluções de equilíbrio e crioprotetora usadas no G4 foram utilizadas nos experimentos seguintes. No segundo experimento, os CCOs foram expostos à solução de equilíbrio por 4 minutos e à solução crioprotetora por 30, 60 ou 90 segundos, sendo imediatamente imersos em N2. O grupo controle não foi vitrificado. Após 7 dias vitrificados, os CCOs foram reaquecidos e maturados in vitro por 30 horas. As taxas de retomada de meiose e maturação nuclear foram avaliadas após o período de maturação. No terceiro experimento, os CCOs foram vitrificados com o tempo de exposição à solução crioprotetora de 60 segundos. O grupo controle não foi vitrificado. Após 7 dias vitrificados, os CCOs foram reaquecidos, maturados in vitro e ativados partenogeneticamente. Taxas de clivagem, mórula e blastocistos foram observadas durante 5 dias. No primeiro experimento, o grupo controle apresentou taxas de retomada de meiose (76,3%) e maturação nuclear (50%) superiores às obtidas nos grupos expostos as soluções crioprotetoras. No mesmo experimento, o G1 apresentou taxas de retomada de meiose (48,6%) e maturação nuclear (21,6%) inferiores quando comparado aos outros grupos expostos. No segundo experimento, o grupo controle apresentou taxas de retomada de meiose (79,6%) e maturação nuclear (36,3%) superiores em relação aos grupos vitrificados. Entretanto, dentre os grupos vitrificados, não houve diferença estatística. No terceiro experimento, as taxas de clivagem (65,3%) e mórula (38,8%) do grupo controle foram superiores em relação ao grupo vitrificado (14,5 % e 1,8 %, respectivamente). Entretanto, as taxas de blastocistos foram similares no grupo vitrificado e no grupo controle. Os resultados obtidos a partir dos nossos experimentos mostraram que a exposição à etilenoglicol e dimetilsulfóxido, em associação e em determinadas concentrações, pode ser tóxica para CCOs de Rattus norvegicus e prejudicar a maturação nuclear e o desenvolvimento embrionário posteriores. Portanto, são necessários mais experimentos para determinar condições adequadas para vitrificação de CCOs de Rattus norvegicus.