Ausência da proteína Nek1 aumenta a instabilidade genômica e o recrutamento da proteína 53BP1 em células de glioblastoma

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dc.contributor.advisorMoura, Dinara Jaqueline
dc.contributor.authorArgenti, Marco Raabe
dc.date.accessioned2023-10-20T18:31:41Z
dc.date.available2023-10-20T18:31:41Z
dc.date.date-insert2023-10-20
dc.date.issued2023-02-28
dc.descriptionDissertação (Mestrado)-Programa de Pós-Graduação em Patologia, Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
dc.description.abstractIntrodução: Gliomas são neoplasias de células gliais que compreendem a maioria dos tumores primários do SNC, sendo o glioblastoma multiforme (GB) o tipo maligno mais comum, representando 48% entre os tumores malignos do SNC. Os GB são agressivos e têm um prognóstico ruim, mesmo com a tríade de tratamento: ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia com temozolomida (TMZ), tendo uma sobrevida média baixa de em torno de 14,6 meses. A busca por novos alvos moleculares e estratégias terapêuticas é fundamental. A proteína Nek1 é importante na resposta a danos no DNA, pois interage com proteínas envolvidas nas vias de reparo, apoptose e regulação de ciclo celular, tais como a 53BP1; estudos recentes têm apontado seu envolvimento na quimiorresistência e progressão tumoral. A Nek1, por ser uma proteína com funções cruciais na estabilidade genética através de diversos mecanismos, possui inúmeras rotas bioquímicas que podem ser afetadas na sua presença, ausência ou variação de expressão. Sua interação com proteínas como Ku80, ATR/ATM, Chk1, VHL, MRE11, MSH6 e Rad54 são exemplos de como a Nek1 mostra-se relevante na manutenção da homeostasia genética, envolvendo mecanismos de estabilização de forquilhas de replicação, parada de ciclo, reparo de DNA e outras funções associadas ao microambiente celular. A 53BP1 é outra proteína chave deste estudo, possuindo um papel diretamente relacionado com outra estrutura conhecida no contexto tumoral, a proteína BRCA1. Seu envolvimento sinérgico com a BRCA1 dá-se através da regulação e direcionamento às vias de HR e NHEJ nas primeiras etapas após a sinalização de dano. Objetivos: Analisar a genotoxicidade utilizando o teste de micronúcleo em linhagens com a proteína Nek1 Knockout (Nek1-KO) durante um protocolo clínico simulado, após tratamento com TMZ e o radiomimético zeocina, assim como avaliar a relação da ausência da proteína Nek1 no recrutamento da proteína 53BP1, utilizando uma linhagem com a proteína 53BP1 truncada fluorescente. Metodología: As células (Nek1-WT e Nek1-KO) foram tratadas com TMZ e zeocina por 7 dias, após o tratamento foram lavadas e incubadas com citocalasina B por 36h, fixadas e coradas para avaliação da formação de micronúcleos. O recrutamento da proteína 53BP1 também foi avaliado nas linhagens Nek1-WT e Nek1-KO, por microscopia de fluorescência; após tratamentos, imagens foram adquiridas por 24h no InCell Analyzer 2200 e a contagem de foci da 53BP1 foi mensurada. Resultados e Conclusão: Os resultados indicam um aumento de genotoxicidade na linhagem Nek1-KO, indicando um envolvimento desta proteína na manutenção da estabilidade genômica. Adicionalmente, foi possível observar uma diminuição na resolução de quebras duplas, pela marcação mais persistente da proteína 53BP1 na linhagem sem a proteína Nek1 (U87-KO), sugerindo uma relação da proteína Nek1 no recrutamento de outras proteínas envolvidas no reparo de quebras duplas.
dc.description.abstract-enIntroduction: Gliomas are glial cell neoplasms which comprise the majority of primary CNS tumors, with glioblastoma multiforme (GB) being the most common malignant type, representing 48% of CNS malignant tumors. GB are aggressive and have a poor prognosis, even with the triad of treatment: surgical resection, radiotherapy and chemotherapy with temozolomide (TMZ), with a low average survival, around 14,6 months. The search for new molecular targets and therapeutic strategies is essential. The Nek1 protein is key in the response to DNA damage, as it interacts with proteins involved in repair, apoptosis and cell cycle regulation pathways, such as 53BP1; recent studies have pointed to its involvement in chemoresistance and tumor progression. Nek1 is a protein with crucial mechanisms on genetic stability through many mechanisms, it works in many biochemical routes that may be affected by its presence, the lack of it or expression variability. Its interaction with proteins such as Ku80, ATR/ATM, Chk1, VHL, Mre11, MSH6 and Rad54 are examples of how Nek1 is relevant on maintaining the genetic homeostasis, evolving replication fork stability mechanisms, cell cycle arrest, DNA repair and other functions linked to the cellular microenvironment. 53BP1 is another key protein of this study, having a direct relation with another known structure in the tumoral context, the BRCA1 protein. Its synergistic role with BRCA1 happens through the regulation and direction to the HR and NHEJ pathways on the first steps after a damage occurs. Aim of study: To analyze genotoxicity using the micronucleus test in strains with the Nek1 Knockout protein (Nek1-KO) during a simulated clinical protocol, after treatment with TMZ and the radiomimetic zeocin, as well as to evaluate the relationship between the absence of the Nek1 protein and the recruitment of 53BP1 protein, using a strain with the truncated 53BP1 protein. Methodology: Cells (Nek1-WT and Nek1-KO) were treated with TMZ and zeocin for 7 days, after treatment they were washed and incubated with cytochalasin B for 36h, fixed and stained to evaluate the formation of micronuclei. Recruitment of 53BP1 protein was also evaluated in Nek1-WT and Nek1-KO strains by fluorescence microscopy; after treatments, images were acquired for 24h in the InCell Analyzer 2200 and the fluorescence intensity of 53BP1 was measured. Results and Conclusion: The results indicate an increase in genotoxicity in the Nek1-KO cell line, indicating an involvement of this protein in the maintenance of genomic stability. Additionally, it was possible to observe a decrease in the resolution of double breaks, due to the more persistent labeling of the 53BP1 protein in the strain without the Nek1 protein (U87-KO), suggesting a relationship of the Nek1 protein in the recruitment of other proteins involved in the repair of double breaks.
dc.identifier.urihttps://repositorio.ufcspa.edu.br/handle/123456789/2386
dc.language.isopt_BR
dc.relation.requiresTEXTO - Adobe Reader
dc.rightsAttribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0 Brazilen
dc.rightsAcesso Aberto Imediatopt_BR
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/br/
dc.subjectGlioblastoma
dc.subjectResposta ao dano de DNA
dc.subjectNek1
dc.subject53BP1
dc.subject[en] DNA damage Responseen
dc.titleAusência da proteína Nek1 aumenta a instabilidade genômica e o recrutamento da proteína 53BP1 em células de glioblastoma
dc.typeDissertação
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