Ausência da proteína Nek1 aumenta a instabilidade genômica e o recrutamento da proteína 53BP1 em células de glioblastoma

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2023-02-28
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Introdução: Gliomas são neoplasias de células gliais que compreendem a maioria dos tumores primários do SNC, sendo o glioblastoma multiforme (GB) o tipo maligno mais comum, representando 48% entre os tumores malignos do SNC. Os GB são agressivos e têm um prognóstico ruim, mesmo com a tríade de tratamento: ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia com temozolomida (TMZ), tendo uma sobrevida média baixa de em torno de 14,6 meses. A busca por novos alvos moleculares e estratégias terapêuticas é fundamental. A proteína Nek1 é importante na resposta a danos no DNA, pois interage com proteínas envolvidas nas vias de reparo, apoptose e regulação de ciclo celular, tais como a 53BP1; estudos recentes têm apontado seu envolvimento na quimiorresistência e progressão tumoral. A Nek1, por ser uma proteína com funções cruciais na estabilidade genética através de diversos mecanismos, possui inúmeras rotas bioquímicas que podem ser afetadas na sua presença, ausência ou variação de expressão. Sua interação com proteínas como Ku80, ATR/ATM, Chk1, VHL, MRE11, MSH6 e Rad54 são exemplos de como a Nek1 mostra-se relevante na manutenção da homeostasia genética, envolvendo mecanismos de estabilização de forquilhas de replicação, parada de ciclo, reparo de DNA e outras funções associadas ao microambiente celular. A 53BP1 é outra proteína chave deste estudo, possuindo um papel diretamente relacionado com outra estrutura conhecida no contexto tumoral, a proteína BRCA1. Seu envolvimento sinérgico com a BRCA1 dá-se através da regulação e direcionamento às vias de HR e NHEJ nas primeiras etapas após a sinalização de dano. Objetivos: Analisar a genotoxicidade utilizando o teste de micronúcleo em linhagens com a proteína Nek1 Knockout (Nek1-KO) durante um protocolo clínico simulado, após tratamento com TMZ e o radiomimético zeocina, assim como avaliar a relação da ausência da proteína Nek1 no recrutamento da proteína 53BP1, utilizando uma linhagem com a proteína 53BP1 truncada fluorescente. Metodología: As células (Nek1-WT e Nek1-KO) foram tratadas com TMZ e zeocina por 7 dias, após o tratamento foram lavadas e incubadas com citocalasina B por 36h, fixadas e coradas para avaliação da formação de micronúcleos. O recrutamento da proteína 53BP1 também foi avaliado nas linhagens Nek1-WT e Nek1-KO, por microscopia de fluorescência; após tratamentos, imagens foram adquiridas por 24h no InCell Analyzer 2200 e a contagem de foci da 53BP1 foi mensurada. Resultados e Conclusão: Os resultados indicam um aumento de genotoxicidade na linhagem Nek1-KO, indicando um envolvimento desta proteína na manutenção da estabilidade genômica. Adicionalmente, foi possível observar uma diminuição na resolução de quebras duplas, pela marcação mais persistente da proteína 53BP1 na linhagem sem a proteína Nek1 (U87-KO), sugerindo uma relação da proteína Nek1 no recrutamento de outras proteínas envolvidas no reparo de quebras duplas.
Description
Dissertação (Mestrado)-Programa de Pós-Graduação em Patologia, Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
Keywords
Glioblastoma, Resposta ao dano de DNA, Nek1, 53BP1, [en] DNA damage Response
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