Implementação da produção de sondas de DNA para hibridização in situ fluorescente
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Data
2018
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Resumo
Introdução: A tecnologia de citogenética molecular de hibridização in situ
fluorescente (FISH) permite a identificação de alterações cromossômicas
submicroscópicas tanto em neoplasias como em doenças congênitas. Nas
neoplasias, a identificação destas anomalias auxilia no diagnóstico,
determinação da alternativa terapêutica mais adequada e indicação de
prognóstico. Em indivíduos portadores de malformações múltiplas e déficit
cognitivo, permite a investigação de alterações cromossômicas
submicroscópicas que não são identificados pela técnica clássica de cariótipo.
O diagnóstico citogenético molecular ainda é muito distante da realidade do
nosso Sistema Único de Saúde, geralmente disponibilizado por meio de
iniciativas pontuais e ligadas a projetos de pesquisa, devido ao alto custo das
sondas comerciais disponíveis para FISH. Assim, há uma grande demanda
reprimida, o que retarda ou mesmo impossibilita o diagnóstico, trazendo grande
sofrimento físico e psíquico aos pacientes e seus familiares.
Objetivos: Implementar a manufatura de sondas de DNA para hibridização in
situ fluorescente no Laboratório de Citogenética da UFCSPA.
Material e Métodos: Neste trabalho desenvolvemos as sondas para detecção
da deleção 22q11.2, alterações no gene MLL e fusão dos genes BCR-ABL1. O
desenvolvimento in house das sondas de FISH consiste em vários processos
sequenciais, com etapas de checagem. Inicialmente foram identificados e
selecionados os cromossomos artificiais de bactérias (BACs), estes foram
cultivados, com posterior extração e amplificação de DNA. Depois os DNAs
amplificados foram marcados com fluorocromos pela técnica de Nick-translation. Após o desenvolvimento das sondas, realizou-se a validação em
amostras normais e alteradas.
Resultados: O conjunto de sondas desenvolvidas para a detecção da deleção
22q11.2 permitiu a detecção da alteração em amostra alterada, tanto em
metáfases quanto em interfases, apresentando 93,55% de sensibilidade, 99,2%
de especificidade e 99,8% de eficiência em amostras normais. As sondas
desenvolvidas para investigação de alterações no gene MLL apresentaram em
amostras normais sensibilidade de 94,65%, especificidade de 100% e
eficiência de 99,3%. Já as sondas desenvolvidas para a detecção da fusão dos
genes BCR-ABL1, não puderam ser validadas em amostras normais devido a
presença de sinais inespecíficos em uma das sondas manufaturadas. Todavia,
em amostras alteradas foi possível detectar a fusão destes genes. Com a
manufatura in house das sondas chegamos a um custo por amostra 8,5 vezes
menor do que quando comparado aos valores das sondas comerciais.
Conclusão: A implementação do desenvolvimento das sondas foi eficaz,
sendo que as sondas del22q11.2 e MLL apresentaram valores adequados no
processo de validação. Para validar as sondas de detecção da fusão dos genes
BCR-ABL1 será necessária a compra de um novo clone para marcar o gene
BCR. O grupo de pesquisa do Laboratório de Citogenética da UFCSPA
pretende continuar com o desenvolvimento de sondas home-brew para
investigação de outras alterações cromossômicas associadas a síndromes
genéticas e neoplasias.
Descrição
Tese (Doutorado)-Programa de Pós-Graduação em Patologia, Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
Palavras-chave
Citogenética, FISH, [en] Cytogenetics, [en] In Situ Hybridization, Fluorescence, [en] Homebrew Probes, [en] Microdeletion Syndrome