Aspectos moleculares e clínicos do sistema Rh em doadores de sangue e na Doença Hemolítica do Feto e do Recém-nascido

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dc.contributor.advisorFiegenbaum, Marilu
dc.contributor.advisor-coAlmeida, Silvana de
dc.contributor.authorRodrigues, Mirelen Moura de Oliveira
dc.contributor.departmentPrograma de Pós-Graduação em Biociências
dc.date.accessioned2024-06-24T16:48:23Z
dc.date.available2024-06-24T16:48:23Z
dc.date.date-insert2024-06-24
dc.date.issued2024
dc.descriptionTese (Doutorado)-Programa de Pós-Graduação em Biociências, Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
dc.description.abstractIntrodução: O sistema Rh é um dos mais importantes sistemas de grupos sanguíneos, pois é considerado altamente imunogênico e polimórfico. Dois genes codificam os antígenos do sistema Rh, RHD e RHCE, sendo os mais importantes os antígenos D, C, c, E, e. O desenvolvimento de anticorpos contra antígenos do sistema Rh está associado a reações transfusionais hemolíticas imediatas e tardias e a Doença Hemolítica do Feto e do Recém-nascido (DHFN). No âmbito da imunohematologia, as técnicas de sequenciamento de DNA podem ser muito úteis para elucidar casos de discrepâncias entre genotipagem e fenotipagem e para identificação de novas variantes de grupos sanguíneos. Objetivos: Compreender as discrepâncias entre os resultados de genotipagem e fenotipagem para os antígenos C/c, E/e em amostras de doadores de sangue do Hospital de Clínicas de Porto Alegre utilizando o sequenciamento das regiões codificantes e adjacentes dos genes RHD e RHCE com discrepância, avaliando a presença de possíveis variantes que expliquem a discrepância. Devido à grande importância dos antígenos do sistema Rh no desenvolvimento da DHFN, a tese também tem como objetivo realizar uma busca sistemática na literatura sobre o tema DHFN e a frequência de anticorpos antieritrocitários em gestantes descrevendo mais prevalentes. Método: O presente estudo avaliou 395 amostras fenotipadas e genotipadas para os antígenos C/c e E/E de doadores de sangue do Hospital de Clínicas, dentre estas foram avaliadas quais amostras apresentaram discrepâncias entre genótipo e fenótipo para os alelos RHCE*e/*E (rs609320) e RHCE*c/*C (rs676785). A fenotipagem foi realizada utilizando a metodologia de tubo com antissoros monoclonais e a genotipagem através da técnica de PCR em tempo real utilizando sistema TaqMan®. As amostras discrepantes para os dois alelos foram sequenciadas utilizando 20 pares de primers para abranger as regiões codificantes e adjacentes dos éxons dos genes RHD e RHCE. As reações de sequenciamento foram realizadas pelo método Sanger. Também foi realizada uma busca sistemática na literatura sobre o desenvolvimento de DHFN e a presença aloimunização em gestantes. O estudo foi conduzido sob aprovação do CEP da UFCSPA (nº 2.753.780). Resultados: Dentre as 395 amostras avaliadas para as metodologias de genotipagem e fenotipagem, 15 apresentaram discrepância entre genótipo e fenótipo para os dois alelos investigados concomitantemente, em duas amostras a análise do sequenciamento confirmou o resultado obtido na genotipagem para o alelo RHCE*E/*e. Foram identificadas variantes, que possivelmente possam explicar as discrepâncias nestas amostras. Dentre as variantes encontradas, duas ainda não estão descritas. Utilizando ferramentas de análise in silico foi possível observar que as variantes podem apresentar potencial de causar alterações na expressão da proteína RhCE e, consequentemente, na expressão dos alelos. A variante encontrada no éxon 6 do gene RHCE foi classificada como “provável dano” utilizando o software PolyPhen-2 com score de 0,999 (sensibilidade = 0,99) e classificada como “tolerada” pelo software SIFT. A segunda nova variante descrita, localizada no final do íntron 7 do gene RHCE, utilizando o software RegulomeDB foi obtido um score de 1,0 o que significa que a nova variante pode alterar a ligação e à expressão gênica. A partir da busca sistemática sobre DHFN e aloimunização, revisamos 75 artigos publicados, ao total 13.966 gestantes apresentavam aloimunização. Os anticorpos mais prevalentes neste estudo de revisão do sistema foram, anti-D (35,01%), anti-K (14,69%), anti-E (11,21%), anti-c (5,48%), anti-C (4,93%) e anti-M (2,35%). Conclusão: Embora o genótipo seja preditor do fenótipo, há algumas situações em que expressão gênica é alterada, como por exemplo, no sistema Rh a presença de antígenos fracos e parciais. Nosso estudo contribui com a identificação de novas variantes que possivelmente podem ter influência na expressão da proteína RhCE. Em relação a DHFN, embora o anti-D ainda seja o anticorpo mais frequente associado a DHFN, podemos observar que outros anticorpos contra antígenos dos sistemas Rh, Kell e MNS apresentam grande prevalência, principalmente, o anti-K e anti-E. Sendo assim, há a necessidade de atentar para a DHFN com o entendimento de que outros anticorpos contra antígenos de grupos sanguíneos estão associados ao desencadeamento da doença implicando em anemia com implicação leve a grave e inclusive no óbito do feto ou recém-nascido e de que é necessário identificar e acompanhar a gestantes com risco de incompatibilidade materno fetal.
dc.description.abstract-enIntroduction: The Rh blood system is one of the most important blood group systems, as it is considered highly immunogenic and polymorphic. Two genes encode the antigens of the Rh system, RHD and RHCE, the antigens D, C, c, E, and e are the most important antigens of this system. The development of antibodies against Rh system antigens is associated with immediate and late hemolytic transfusion reactions and Hemolytic Disease of the Fetus and Newborn (HDFN). In the context of immunohematology, DNA sequencing techniques can be very useful for elucidating cases of discrepancies between genotyping and phenotyping, and for identifying new blood group variants. Aim: Understand the discrepancies between the genotyping and phenotyping results for the C/c, E/e antigens in samples from blood donors at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre using sequencing of the coding and adjacent regions of the RHD and RHCE genes with discrepancies, evaluating the presence of possible variants that explain the discrepancy. Due to the great importance of Rh system antigens in the development of HDFN, this thesis also aims to carry out a systematic search in the literature on the topic of HDFN and the frequency of anti-erythrocyte antibodies in pregnant women, describing the most prevalent alloantibodies. Methodology: The present study evaluated 395 samples of phenotype and genotype for C/c and E/E antigens from blood donors at Hospital de Clínicas, among which samples were evaluated that presented discrepancies between genotype and phenotype for the alleles for the RHCE*e/*E (rs609320), and RHCE*c/*C (rs676785) alleles. Phenotyping was performed using tube methodology with monoclonal antisera and genotyping using real-time PCR using the TaqMan® system. The discrepant samples for the two alleles were sequenced using 20 pairs of primers to cover the coding and adjacent regions of the exons of the RHD and RHCE genes. Sequencing reactions were performed using the Sanger method. A systematic search was also carried out in the literature on the development of HDFN and the presence of alloimmunization in pregnant women. The study was conducted with approval from UFCSPA ethical committee (number 2,753,780). Results: Among the 395 samples evaluated for genotyping and phenotyping methodologies, 15 samples showed a discrepancy between genotyping and phenotyping, 2 confirmed the RHCE*E/*e genotype. Variants were identified, which may explain the discrepancies in these samples. Among the variants found, two have not yet been described. Using in silico analysis tools, it was possible to observe that the variants have great potential to cause changes in protein expression and, consequently, in the expression of alleles. The variant found in exon 6 of the RHCE gene was classified as “probable damage” using the PolyPhen-2 software with a score of 0.999 (sensitivity = 0.99) and classified as “tolerated” by the SIFT software. The second new variant described, located at the end of intron 7 of the RHCE gene, using the RegulomeDB software, obtained a score of 1.0, which means that the new variant can alter gene binding and expression. From the systematic search on HDFN and alloimmunization, we reviewed 75 published articles; a total of 13,966 pregnant women had alloimmunization. The most prevalent antibodies in this system review study were anti-D (35.01%), anti-K (14.69%), anti-E (11.21%), anti-c (5.48 %), anti-C (4.93%), and anti-M (2.35%). Conclusions: Although the genotype is a phenotype predictor, there are some situations in which gene expression is altered, such as, in the Rh system, the presence of weak and partial antigens. Our study contributes to identifying new variants that may influence the expression of the RhCE protein. Regarding to HDFN, although anti-D is still the most common, we can observe that other antibodies against antigens from the Rh, Kell, and MNS systems are highly prevalent, mainly anti-K and anti-E. Therefore, there is a need to pay attention to HDFN with the understanding that other antibodies against blood group antigens are associated with the onset of the disease, resulting in mild to severe anemia and even death of the fetus or newborn and that it is necessary to identify and monitor pregnant women at risk of maternal-fetal incompatibility
dc.identifier.urihttps://repositorio.ufcspa.edu.br/handle/123456789/2749
dc.language.isopt_BR
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dc.rightsAcesso Embargaopt_BR
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/br/
dc.subjectSistema do Grupo Sanguíneo Rh-Hrpt_BR
dc.subjectDoença Hemolítica do Feto e do Recém-nascidopt_BR
dc.subjectRh variantespt_BR
dc.subjectDiscrepâncias entre genotipagem e fenotipagempt_BR
dc.subject[en] Rh-Hr Blood-Group Systemen
dc.subject[en] Hemolytic disease of the fetus and newbornen
dc.subject[en] Rh genetic variants,en
dc.subject[en] Genotype and phenotype discrepancies.en
dc.titleAspectos moleculares e clínicos do sistema Rh em doadores de sangue e na Doença Hemolítica do Feto e do Recém-nascidopt_BR
dc.typeTese
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