Doenças monogênicas raras: caracterização molecular e computacional de variantes genéticas

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dc.contributor.advisorFiegenbaum, Marilu
dc.contributor.authorDeconte, Desirée
dc.contributor.departmentPrograma de Pós-Graduação em Patologia
dc.date.accessioned2025-02-28T20:57:33Z
dc.date.available2025-02-28T20:57:33Z
dc.date.date-insert2025-02-28
dc.date.issued2024-09-06
dc.descriptionTese (Doutorado)-Programa de Pós-Graduação em Patologia, Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
dc.description.abstractIntrodução: As doenças monogênicas representam um grupo extenso de alterações fenotípicas que afetam a população mundial: existem, hoje, cerca de 7.000 doenças monogênicas conhecidas. Apesar de extensas investigações para elucidar a etiologia molecular específica de doenças raras, a identificação de genes relacionados a elas são, ainda, escassos. Com a etiologia desconhecida, o diagnóstico para a maioria dos pacientes com suspeita de alguma condição monogênica rara continua imprecisa. Sendo assim, a necessidade de buscar o diagnóstico e a caracterização molecular para esses pacientes é essencial para estabelecer correlações entre o genótipo e o fenótipo, melhorar o manejo e o tratamento destes pacientes e para possibilitar a identificação de fatores etiológicos e prognósticos para um aconselhamento familiar mais preciso. Objetivos: Realizar a avaliação molecular de pacientes com suspeita clínica de diferentes alterações monogênicas raras associadas aos genes CHST3, EDNRB, FGFR2, FOXC2, KIAA0586, NFIX e SOX9, bem como realizar a predição in silico das variantes encontradas. Material e Métodos: O DNA de todos os pacientes e seus respectivos progenitores foi isolado pelo método de salting-out e amplificado pelo método de reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional com o primers desenhados para cobrir todas as regiões codificantes dos genes. O sequenciamento das amostras foi realizado através do sequenciador automático ABI-PRISM 3130 Genetic Analyzer e os eletroferogramas gerados analisados com o auxílio do programa Chromas Lite. Para as análises in silico serão usadas à nível gênico as 25 ferramentas recomendadas pelas Diretrizes para Interpretação de Variantes de Sequências da ACMG quanto às análises preditivas para troca de sentido, alteração de sítios de splicing e conservação de nucleotídeos. No nível protéico, os quatro níveis hierárquicos de sua estrutura serão avaliados Além disso, algoritmos de predição estipulados pela American College of Medical Genetics and Genomics e a Association for Molecular Pathology serão utilizados para realizar a avaliação dos critérios de patogenicidade das variantes encontradas a nível populacional, de estrutura proteica e conservação evolutiva. Resultados: Foram encontradas variações de sequência nos genes CHST3, EDNRB, FGFR2, KIAA0586 e NFIX. No paciente diagnosticado com displasia esquelética foi encontrada uma nova variante missense em homozigose no gene CHST3 por NGS, confirmada, posteriormente, por sequenciamento de Sanger. Alterações no gene FGFR2 foram encontradas tanto para o indivíduo diagnosticado com síndrome de Pfeiffer, quanto para o paciente com síndrome de Apert. Na síndrome de Pfeiffer, uma variante missense de novo foi encontrada na região de sítio aceptor de splicing entre os exons 8 e 9. Para a síndrome de Apert, outra variante missense de novo em heterozigose foi encontrada. Ainda, uma nova variante também foi identificada no indivíduo com síndrome de Marshall-Smith: duplicação de sete nucleotídeos no éxon 8 do gene NFIX . Para o paciente com diagnóstico de síndrome de Shah-Waardenburg foi encontrada uma variante missense em homozigose no gene EDNRB. A análise do painel de genes para ciliopatias identificou uma variante em KIAA0586 herdada do pai no paciente diagnosticado com síndrome de Hydrolethalus. Ainda, uma análise por rtPCR encontrou uma possível variante intrônica também no gene KIAA0586 na amostra materna, possivelmente herdada pela filha. Por fim, para os genes FOXC2 e SOX9 não foi encontrada nenhuma mutação no sequenciamento dos respectivos pacientes. Conclusão: Neste trabalho foi avaliado um único paciente com suspeita de doença monogênica rara para cada gene associado ao respectivo fenótipo. Apesar de nossa análise molecular cobrir toda a região codificante dos genes, para dois destes pacientes não foi observada nenhuma mutação. Para os demais casos, foram observadas duas mutações previamente descritas para pacientes com craniossinostoses (rs1057519041 e rs77543610) e quatro variantes novas. Para as mutações novas, análises in silico foram realizadas para auxiliar na elucidação da probabilidade de dano ao genoma, bem como na predição da proteína alterada e, ainda, na compreensão do funcionamento do gene investigado. Estes resultados reforçam a existência de uma heterogeneidade genética entre casos de mesmo diagnóstico clínico, bem como a importância do diagnóstico molecular para cada paciente de forma a fornecer um diagnóstico completo mais efetivo e preciso e um aconselhamento genético mais personalizado.
dc.description.abstract-enIntroduction: Monogenic conditions represent a large group of phenotype alterations that affect the population worldwide. Nowadays there are on average 7.000 known monogenic diseases. Despite extensive investigations to diagnose molecular causes for rare phenotype conditions, the identification for related genes are still very low. With an unknown etiology, for most patients with a rare disease the diagnosis remains inaccurate. Therefore the need for a precise molecular characterization and an optimum diagnosis is fundamental to correlate genotype and phenotype, to give a better treatment for this group of patients and to be able to identify etiologic factors to perform a better genetic counseling. Aim of study: To perform a molecular analysis of patients with a suspicious diagnosis of rare monogenic diseases associated with the following genes: CHST3, EDNRB, FGFR2, FOXC2, KIAA0586, NFIX e SOX9. Also, for new identified variants, to predict its function using in silico tools. Materials and methods: DNA from both patient and parents blood samples were isolated by salting-out method and amplified by conventional polymerase chain reaction (PCR) with primers designed to cover all gene coding regions. Sample’s sequencing was performed using the automatic sequencer ABI-PRISM 3130 Genetic Analyzer and electropherograms were analyzed with the Chromas Lite program. For in silico assessments, 25 computational tools recommended by the ACMG Guidelines for Interpreting Sequence Variants will be used to analyze the variant at gene level. At protein level, all four structures levels will be properly evaluated. Moreover, prediction algorithms stipulated by the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology will be used to evaluate the new variants' pathogenicity criteria at a population level, as well as protein structure and evolutionary conservation. Results: We found genetic alterations in CHST3, EDNRB, FGFR2, KIAA0586 and NFIX genes. In the individual diagnosed with skeletal dysplasia we found a new recessive homozygous missense variant at gene CHST3 by NGS, later confirmed by Sanger sequencing. Gene alterations at FGFR2 were found for both patients diagnosed with Pfeiffer syndrome and Apert syndrome. In the individual with Pfeiffer syndrome we found a de novo mutation at an acceptor splicing site in intron 8 – exon 9 boundary at FGFR2. For the patient with Apert syndrome another de novo heterozygous missense variant was found on the same gene. A new variant was also identified in the individual diagnosed with Marshall-Smith syndrome: a duplication of seven nucleotides was found on NFIX gene’s exon 8. For the patient with Shah-Waardenburg syndrome, we found a new homozygous missense variant at EDNRB. An exome analysis of genes associated with ciliopathies identified a variant on KIAA0586 on the patient with Hydrolethalus syndrome inherited from the father. Moreover, rtPCR analysis showed an intronic variant at KIAA0586 on the mother’s genome, which may be also inherited by the child. No mutation was found in the patients’ sequence associated with FOXC2 e SOX9 genes. Conclusion: In this study we investigated one patient for each gene associated with a rare monogenic disease diagnosis. Although all coding region sequencing analysis was performed, two patients did not have any variant found in their sequence. For the other six cases, we found two previously reported variants in probands with craniosynostosis (rs1057519041 e rs77543610) and four brand new variants. For the new molecular findings, we performed in silico assessments in order to elucidate variants probability on genome damage, as well as protein structure prediction. Moreover, computational tools aid us to better understand the investigated gene function and roles in the human genome. Our results reinforce the existence of a genetic heterogeneity between cases of same clinical diagnosis, as well as the importance of molecular diagnosis for each patient in order to provide a more effective and precise diagnosis and a personalized genetic counseling.
dc.identifier.urihttps://repositorio.ufcspa.edu.br/handle/123456789/3238
dc.language.isopt_BR
dc.relation.requiresTEXTO - Adobe Reader
dc.rightsAttribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0 Brazilen
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/br/
dc.subjectDoença monogênica
dc.subjectAnálise in silico
dc.subjectGene
dc.subject[en] Monogenic diseaseen
dc.subject[en] In silico assessmenten
dc.subject[en] Geneen
dc.titleDoenças monogênicas raras: caracterização molecular e computacional de variantes genéticas
dc.typeTese
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