Vitrificação de complexos cumulus-oócito imaturos de rattus norvegicus selecionados por azul cresil brilhante
| dc.contributor.advisor | Oliveira, Alexandre Tavares Duarte de | |
| dc.contributor.author | Oliveira, Iáskara Vieira de | |
| dc.date.accessioned | 2019-07-29T18:28:44Z | |
| dc.date.accessioned | 2023-10-09T13:59:04Z | |
| dc.date.available | 2019-07-29T18:28:44Z | |
| dc.date.available | 2023-10-09T13:59:04Z | |
| dc.date.date-insert | 2019-07-29 | |
| dc.date.issued | 2017 | |
| dc.description | Dissertação (Mestrado)-Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre. | pt_BR |
| dc.description.abstract | Uma das principais causas da baixa viabilidade de oócitos de ratos após a criopreservação é a seleção inadequada de gametas através de critérios morfológicos. O desenvolvimento e a validação de novos métodos de seleção de CCOs associados a criopreservação almejam identificar os gametas competentes propiciando resultados de fecundação e desenvolvimento embrionário semelhantes aos obtidos in vivo. O objetivo desse trabalho foi determinar as taxas de clivagem e desenvolvimento embrionário após a ativação partenogenética de CCOs selecionados por diferentes concentrações de BCB e criopreservação. Fêmeas pré-puberes Wistar foram superovuladas com 20 UI de eCG intra peritonial (IP) e submetidas a eutanásia após 48 horas. Os ovários foram retirados da cavidade abdominal e mantidos em PBSm a 37˚C até o momento da escarificação para liberação dos CCOs. A observação e a seleção morfológica dos CCOs foram realizadas com auxílio de estereomicroscópio. No primeiro experimento, CCOs foram selecionados morfologicamente e incubados, em grupos, por 1 h em meio M16 (sem vermelho fenol) contendo BCB, com diferentes concentrações (13 μM, 16 μM e 20 μM) baseadas em Alcoba et al. (2013) (ALCOBA, DD et al. Selection of Rattus norvegicus oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining. Zygote, v. 21, p. 238-245, 2013). Após 30 hs de maturação in vitro (MIV), foi realizada a ativação partenogenética com posterior acompanhamento do desenvolvimento embrionário in vitro. O grupo controle não foi exposto ao corante BCB. Baseado no melhor resultado da primeira etapa, o segundo experimento foi realizado com a seleção de CCOs pela morfologia e na sequência com a incubação em meio com 13 μM de BCB. A eficácia da seleção somada ao efeito da vitrificação dos CCOs foi avaliada pelo desenvolvimento embrionário in vitro após a ativação partenogenética. Os CCOs foram divididos em 4 grupos: BCB (+), BCB (-) , controle I (onde os CCOs foram selecionados morfologicamente, imediatamente maturados in vitro, ativados partenogeneticamente e mantidos in vitro para o desenvolvimento embrionário, sem vitrificação prévia) e controle II (onde os CCOs foram selecionados morfologicamente, vitrificados, maturados in vitro com avaliação do desenvolvimento embrionário in vitro após a ativação partenogenética). Após sete dias vitrificados, os CCOs foram reaquecidos, submetidos a MIV e a ativação partenogenética. Taxas de clivagem, mórula e blastocisto foram observadas durante 5 dias. No primeiro experimento, o grupo BCB 13 μM apresentou taxa de clivagem (41,98% - 55/131) similar aos grupos BCB 16 μM (49,55% - 55/111), controle (47,22% - 51/108) e BCB 20 μM (36,70% - 40/109). Por outro lado, apresentou níveis superiores estatisticamente de desenvolvimento embrionário do estádio de clivagem a mórula (65,45% - 36/55) quando comparado aos demais grupos. No segundo experimento, as taxas de clivagem (47,05% - 72/153) e mórula (33,55% - 51/153) do grupo controle não vitrificado foram superiores aos demais grupos. Entretanto, quando se compara as taxas de desenvolvimento de mórula a partir dos clivados entre os grupos 6 controle vitrificado e BCB (+), este último apresenta resultados estatisticamente melhores (19,23% - 5/26 e 64,7% - 11/17, respectivamente). Os resultados obtidos em nossos experimentos indicam que o teste BCB pode selecionar os gametas mais aptos a processos de manipulação in vitro, como a vitrificação, a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário. Entretanto, em virtude da complexidade dos eventos envolvidos, são necessários mais informações para determinar as condições adequadas para a seleção e a vitrificação de CCOs de Rattus norvegicus. | pt_BR |
| dc.description.abstract-en | One of the major reasons of the low viability of rat oocytes after cryopreservation is inadequate selection of gametes using morphologic criteria. The development and validation of new methods to COCs selection associated to cryopreservation will allow identify the competent gametes and to achieve fecundation and embryo developmental results near to generate in vivo. The objective of this study was to determine the cleavage and embryo developmental rates after parthenogenetic activation of COCs selected by different concentrations of BCB and cryopreservation. Female pre-pubertal Wistar rats were superovulated with 20 IU of eCG by intraperitoneal (IP) injection and euthanized after 48 h. Ovaries were removed from the abdominal cavity and maintained in PBSm at 37°C until scarification to release the COCs. Observation and morphological selection of COCs were performed using a stereomicroscope. In the first experiment, COCs were morphologically selected and incubated in groups for 1 h in M16 medium (without phenol red) with increasing of concentrations of BCB (13 M, 16 M, and 20 M) based on previous work of Alcoba et al. (2013) (ALCOBA, DD et al. Selection of Rattus norvegicus oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining. Zygote, v. 21, p. 238-245, 2013). After 30 h, parthenogenetic activation was performed with subsequent monitoring of in vitro embryo development. The control group was not exposed to the BCB stain. Based on the best results of the first step, the second experiment was performed with the selection of COCs by morphology and in sequence with incubation in medium with 13 M BCB. The efficacy of the selection added to the effect of the vitrification of the COCs was evaluated by embryo development in vitro after parthenogenetic activation. The COCs were divided into 4 groups: BCB (+), BCB (-), control I (in which COCs were selected morphologically, immediately matured in vitro, parthenogenetically activated and maintained in vitro for embryonic development without prior vitrification), and control II (in which COCs were selected morphologically, vitrified, matured in vitro with evaluation of embryonic development in vitro after parthenogenetic activation). After seven days, the COCs were warmed, submitted for in vitro maturation (IVM) and parthenogenetic activation. Rates of cleavage, morula and blastocyst development were observed for 5 days. In the first experiment, the 13 M BCB group presented a cleavage rate (41.98% - 55/131) similar to the 16 M BCB group (49.55% - 55/111), control (47.22% - 51/108), and 20 M BCB (36.70% - 40/109). On the other hand, the 13 M BCB group presented statistically superior levels of embryonic development from the cleavage stage to the morula stage (65.45% - 36/55) when compared to the other groups. In the second experiment, the cleavage rates (47.05% - 72/153) and morula (33.55% - 51/153) of the non-vitrified control group were higher than the other groups. However, when the rates of morula development from the cleavage stage between the control and BCB (+) groups are compared, the latter showed statistically better results (19.23% - 5/26 vs. 64.7% - 11/17, respectively). The results obtained in our experiments indicate that the BCB test can select the gametes most suitable for in vitro manipulation processes, such as vitrification, oocyte maturation, and embryonic development. However, due to the complexity of the events involved, further experiments are required to simplify the conditions suitable for selection and vitrification of Rattus norvegicus COCs. | pt_BR |
| dc.identifier.uri | https://repositorio.ufcspa.edu.br/handle/123456789/691 | |
| dc.language.iso | pt_BR | pt_BR |
| dc.relation.requires | Adobe Reader | pt_BR |
| dc.rights | Acesso Aberto Imediato | * |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ | * |
| dc.subject | Vitrificação | pt_BR |
| dc.subject | Azul Cresil Brilhante | pt_BR |
| dc.subject | Complexo Cumulus-Oócitos | pt_BR |
| dc.subject | Embriões | pt_BR |
| dc.subject | Ratos | pt_BR |
| dc.subject | [en] Vitrification | en |
| dc.subject | [en] Coloring Agents | en |
| dc.subject | [en] Embryonic Structures | en |
| dc.subject | [en] Rats | en |
| dc.title | Vitrificação de complexos cumulus-oócito imaturos de rattus norvegicus selecionados por azul cresil brilhante | pt_BR |
| dc.type | Dissertação | pt_BR |