Vitrificação de complexos cumulus-oócito imaturos de rattus norvegicus selecionados por azul cresil brilhante
Carregando...
Data
2017
Autores
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Resumo
Uma das principais causas da baixa viabilidade de oócitos de ratos após a criopreservação é a seleção inadequada de gametas através de critérios morfológicos. O desenvolvimento e a validação de novos métodos de seleção de CCOs associados a criopreservação almejam identificar os gametas competentes propiciando resultados de fecundação e desenvolvimento embrionário semelhantes aos obtidos in vivo. O objetivo desse trabalho foi determinar as taxas de clivagem e desenvolvimento embrionário após a ativação partenogenética de CCOs selecionados por diferentes concentrações de BCB e criopreservação. Fêmeas pré-puberes Wistar foram superovuladas com 20 UI de eCG intra peritonial (IP) e submetidas a eutanásia após 48 horas. Os ovários foram retirados da cavidade abdominal e mantidos em PBSm a 37˚C até o momento da escarificação para liberação dos CCOs. A observação e a seleção morfológica dos CCOs foram realizadas com auxílio de estereomicroscópio. No primeiro experimento, CCOs foram selecionados morfologicamente e incubados, em grupos, por 1 h em meio M16 (sem vermelho fenol) contendo BCB, com diferentes concentrações (13 μM, 16 μM e 20 μM) baseadas em Alcoba et al. (2013) (ALCOBA, DD et al. Selection of Rattus norvegicus oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining. Zygote, v. 21, p. 238-245, 2013). Após 30 hs de maturação in vitro (MIV), foi realizada a ativação partenogenética com posterior acompanhamento do desenvolvimento embrionário in vitro. O grupo controle não foi exposto ao corante BCB. Baseado no melhor resultado da primeira etapa, o segundo experimento foi realizado com a seleção de CCOs pela morfologia e na sequência com a incubação em meio com 13 μM de BCB. A eficácia da seleção somada ao efeito da vitrificação dos CCOs foi avaliada pelo desenvolvimento embrionário in vitro após a ativação partenogenética. Os CCOs foram divididos em 4 grupos: BCB (+), BCB (-) , controle I (onde os CCOs foram selecionados morfologicamente, imediatamente maturados in vitro, ativados partenogeneticamente e mantidos in vitro para o desenvolvimento embrionário, sem vitrificação prévia) e controle II (onde os CCOs foram selecionados morfologicamente, vitrificados, maturados in vitro com avaliação do desenvolvimento embrionário in vitro após a ativação partenogenética). Após sete dias vitrificados, os CCOs foram reaquecidos, submetidos a MIV e a ativação partenogenética. Taxas de clivagem, mórula e blastocisto foram observadas durante 5 dias. No primeiro experimento, o grupo BCB 13 μM apresentou taxa de clivagem (41,98% - 55/131) similar aos grupos BCB 16 μM (49,55% - 55/111), controle (47,22% - 51/108) e BCB 20 μM (36,70% - 40/109). Por outro lado, apresentou níveis superiores estatisticamente de desenvolvimento embrionário do estádio de clivagem a mórula (65,45% - 36/55) quando comparado aos demais grupos. No segundo experimento, as taxas de clivagem (47,05% - 72/153) e mórula (33,55% - 51/153) do grupo controle não vitrificado foram superiores aos demais grupos. Entretanto, quando se compara as taxas de desenvolvimento de mórula a partir dos clivados entre os grupos
6
controle vitrificado e BCB (+), este último apresenta resultados estatisticamente melhores (19,23% - 5/26 e 64,7% - 11/17, respectivamente). Os resultados obtidos em nossos experimentos indicam que o teste BCB pode selecionar os gametas mais aptos a processos de manipulação in vitro, como a vitrificação, a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário. Entretanto, em virtude da complexidade dos eventos envolvidos, são necessários mais informações para determinar as condições adequadas para a seleção e a vitrificação de CCOs de Rattus norvegicus.
Descrição
Dissertação (Mestrado)-Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
Palavras-chave
Vitrificação, Azul Cresil Brilhante, Complexo Cumulus-Oócitos, Embriões, Ratos, [en] Vitrification, [en] Coloring Agents, [en] Embryonic Structures, [en] Rats