Navegando por Autor "Bertoni, Ana Paula Santin"
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Item Análise da sinalização purinérgica em células epidermais humanas após exposição à radiação ultravioleta(2021) Nunes, Walquíria Souza; Wink, Márcia Rosângela; Bertoni, Ana Paula SantinA exposição cutânea à radiação ultravioleta (RUV) é um efeito ambiental inerente à vida humana. Já foi observado, em estudos in vitro, que essa exposição induz a liberação de ATP de células epidermais, principalmente em queratinócitos. O ATP é fundamental para a célula, pois fornece a energia livre de que essas células necessitam para realizar suas atividades. Entretanto, sua presença no espaço extracelular possibilita seu desempenho como molécula de sinalização intercelular. Essa comunicação ocorre através de nucleotídeos e nucleosídeos, dos receptores (divididos em família P1 e P2), bem como das ectonucleotidases que atuam hidrolisando os ligantes, regulando assim a sua disponibilidade. Todos esses componentes formam a sinalização purinérgica, sendo esse sistema envolvido em vários processos patofisiológicos cutâneos. Assim, nosso objetivo foi avaliar se a exposição à radiação ultravioleta é capaz de modular componentes da sinalização purinérgica. Para isso, foi realizada uma revisão sistemática e uma análise in silico para verificação da modulação de purinoreceptores e ectoenzimas após a exposição à RUV. Ademais, foi realizado experimentos de bancada com o intuito de avaliar a atividade enzimática em células Hacat após exposição à UVA e UVB. Os resultados oriundos da revisão sistemática apontam que o ATP é rapidamente liberado de células epidermais, queratinócitos e melanócitos, após a exposição a RUV (1-10 minutos); essa molécula age como um mediador pró-inflamatório induzindo a liberação de IL-1β, IL-6 e COX-2 de queratinócitos e, somado ao caráter inflamatório, o ATP possui um papel na melanogênese e esse processo parece ser dependente do receptor P2X7. As análises in silico não indicam modulação em nenhum elemento da sinalização purinérgica (purinoreceptores ou ectonucleotidases) em melanócitos após a exposição única à RUV nas condições investigadas. Por outro lado, queratinócitos irradiados apresentam um aumento na expressão gênica de P2X4, P2Y11 e P2Y13, e diminuição na expressão de P2Y2. Além disso, as análises in silico indicam aumento nos níveis dos genes ENPP1 e ENTPD4, além de sugerir diminuição nos níveis de ENTPD6. A partir dos resultados experimentais, não foi observado modulação no gene NT5E, que codifica CD73, após única exposição à radiação ultravioleta em queratinócitos. Queratinócitos imortalizados expostos à 3 e 6J/cm2 não apresentam modulação na expressão de NT5E quando comparados ao grupo controle. Esses resultados sugerem o envolvimento da sinalização purinérgica na sinalização parácrina entre o melanócito e o queratinócito após à radiação ultravioleta. Uma melhor compreensão dessa modulação poderá contribuir para um entendimento mais profundo de diversas alterações cutâneas, bem como auxiliar na compreensão de processos fisiológicos, como a pigmentação. Esse conhecimento poderá ser utilizado tanto para uma melhor condução de tratamentos dermatológicos, quanto para elaboração de produtos na indústria farmacêutica voltados para a área estética.Item Influência do proto-oncogene pcph/ntpdase5 na migração celular e na resistência terapêutica contra a temozolomida em glioblastoma multiforme(2014) Bracco, Paula Andreghetto; Wink, Márcia Rosângela; Bertoni, Ana Paula SantinGliomas são os principais tumores primários do sistema nervoso central em humanos. A falta de êxito no tratamento desses tumores esta associada à capacidade de suas células atravessarem os estreitos espaços extracelulares no cérebro, migrando por relativas longas distâncias, tornando difícil uma remoção cirúrgica total e efetiva. Por isso, o tratamento quimioterápico com Temozolomida geralmente acompanha a terapia cirúrgica. O proto-oncogene PCPH, identificado sequencial e funcionalmente como a ecto-enzima degradadora de nucleotídeos NTPDase5, apresenta um perfil expressão desregulado na maioria dos processos neoplásicos, sendo frequentemente diferentes os níveis de expressão quando comparados células normais e tumorais. Recentemente foi observado que nas amostras clínicas mais agressivas de glioblastomas a expressão da NTPDase5 estava mais elevada, estando associada com uma menor sobrevida do paciente. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi realizar uma revisão sistemática a respeito da relação do proto-oncogene NTPDase5/PCPH, bem como da proteína mutada a oncogene ativo mt-NTPDase5/mt-PCPH, nos diferentes processos neoplásicos, a qual acabou por confirmar a relação desse gene com os diferentes tipos de neoplasias e as descobertas e dúvidas remanescentes a respeito do papel desempenhado pelo mesmo. Ainda, verificar o papel da superexpressão do proto-oncogene na atividade migratória e na resistência celular de células de glioma de rato C6 ao tratamento com temozolomida. Nossos resultados demonstram que, após a superexpressão dessa proteína, as células C6 apresentam uma maior atividade migratória e uma resistência elevada ao tratamento com baixas concentrações de temozolomida. Sugere-se que tais observações sejam ainda mais evidentes com a superexpressão do oncogene ativo, mt-NTPDase5, e que o silenciamento de ambas proteínas NTPDase5/mtNTPDase5 pode vir a ser uma alternativa para complementar e potencializar o tratamento a essa neoplasia extremamente agressiva do sistema nervoso central.Item Mesenchymal stem cells derived extracellular vesicles for COVID-19 treatment(2024-05-29) Schultz, Iago Carvalho; Wink, Márcia Rosangela; Bertoni, Ana Paula Santin; Boilard, Eric; Programa de Pós-Graduação em BiociênciasA Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), causada pelo SARS-CoV-2, é uma doença sistêmica caracterizada por uma inflamação maciça e um desequilíbrio do sistema imunológico. Apesar dos esforços globais, o acesso a vacinas e tratamentos antivirais continua desigual. Portanto, terapias complementares de múltiplos alvos facilitariam o manejo dos pacientes. As células-tronco mesenquimais (CTMs) são conhecidas pelo seu potencial imunomodulador através da liberação de proteínas e outras moléculas no espaço extracelular, seja como elementos solúveis ou transportados por vesículas extracelulares (VEs). As VEs surgiram como uma opção terapêutica devido às suas propriedades intrínsecas, como o diâmetro nanométrico, e o seu conteúdo heterogêneo, incluindo pequenas sequências não codificantes envolvidas na repressão ou degradação de genes pós-transcricionais, como os microRNAs. O principal objetivo deste doutorado foi avaliar se as VEs das CTMs poderiam desempenhar um papel terapêutico durante o desenvolvimento da COVID-19. Primeiramente, através de análise bioinformática, analisamos quatro conjuntos de dados de miRNA utilizando diferentes fontes de tecido de células-tronco (medula óssea, cordão umbilical e tecido adiposo) e cruzamos seu conteúdo. Cinquenta e oito miRNAs se sobrepuseram nos quatro conjuntos de dados de miRNA analisados. Sequencialmente, esses miRNAs presentes em pelo menos dois conjuntos de dados foram submetidos ao software miRWalk, que previu 258, 267 e 148 miRNAs direcionados ao 3'UTR de citocinas e quimiocinas, genes de morte celular e cascatas de coagulação, respectivamente. Sequencialmente, para validar os achados in silico, obtivemos CTMs de tecido adiposo humano e avaliamos in vitro o potencial antiinflamatório de suas VEs durante a infecção por SARS-CoV-2. As VEs das CTMs foram isoladas dos sobrenadantes de culturas celulares utilizando centrifugação diferencial seguida de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e caracterizadas por citometria de fluxo, Análise de Rastreamento de Nanopartículas e imunoblotting. A microscopia confocal confirmou que as VEs das CTMs foram internalizadas pela linha celular alveolar, A549-hACE2, e se localizaram ao longo da via endocítica. Para determinar sua funcionalidade, as células A549-hACE2 foram infectadas com SARS-CoV-2 e tratadas com 3, 10, 30, 100 e 300 VEs das CTMs/célula por 24 horas, e os sobrenadantes das culturas celulares foram coletados. A análise multiplex de 30 VEs das CTMs/célula foi suficiente para alterar 32 de 48 mediadores imunológicos. Entre estes, MCP-1, IL-6 e IL8 foram confirmados por ELISA, resultando em uma redução dependente da dose. Além disso, a atividade antiviral das VEs das CTMs foi avaliada. Concentrações mais baixas (3, 10 e 30 VEs das CTMs/célula) não tiveram efeito na redução da replicação viral, embora concentrações mais altas (100 e 300 VEs/célula) mostraram reduções significativas.Item Papel das ecto-nucleotidases em células foliculares de tireoide e no carcinoma papilar de tireoide(2016) Bertoni, Ana Paula Santin; Wink, Márcia Rosângela; Furlanetto, Tania WeberA prevalência de câncer diferenciado de tireoide, especialmente o carcinoma papilar de tireoide (PTC), tem aumentado ao longo das últimas decadas e os mecanismos moleculares envolvidos nesta patologia não são bem compreendidos. Nos últimos anos, a investigação centrou-se em avaliar o microambiente tumoral, e nucleotideos extracelulares (por exemplo, ATP) e nucleosideos (por exemplo, adenosina) têm emergido como importantes moduladores deste microambiente tumoral. O ATP extracelular pode ser hidrolisado pela NTPDase1/CD39 e 2 e, o AMP produzido, é hidrolisado a adenosina pela ecto-5'-nucleotidase (CD73), a qual é considerada um promotor de crescimento tumoral e de metástases. Não há estudos que tenham avaliado atividade ou a expressão gênica das ectonucleotidases em células normais ou tumorais da tireoide. Ainda, o papel de CD73 em PTC é pouco estudado e controverso. No primeiro estudo, demonstrou-se que as linhagens de células derivadas de tireoide normal apresentam uma maior capacidade de hidrolisar ATP e que esta, encontra-se de acordo com uma maior expressão nos níveis de ENTD1-2, enquanto as células tumorais apresentam uma maior capacidade de hidrolisar AMP e apresentam níveis mais elevados mRNA para CD73. No segundo estudo, nossos resultados demonstram que a atividade de CD73 é up-regulada em células foliculares derivadas de PTCs, quando comparadas às células normais de tireoide humana e, ainda que os níveis de mRNA para a CD73 são significativamente mais elevados em PTCs quando comparados a seus tecidos adjacentes não tumorais Além disso, verificou-se que a razão dos níveis de mRNA de CD73 do tecido tumoral em relação ao seu respectivo adajacente não tumoral, apresentou-se maior na presença de hiperplasia nodular no parênquima tireoidiano adjacente quando comparado com tireoidite normal ou linfocítica, na presença de linfonodos com mestástases, na presença de microinvação do local, na maior classificação de risco ATA e com maior tamanho tumoral. Dessa forma nós sugerimos que a elevada expressão da CD73 induz um o acúmulo de adenosina extracelular no microambiente tumoral, sugerindo que haja um crosstalk entre a célula normal e tumoral, podendo favorecer nichos de acumulação de ATP e/ou adenosina, o que pode promover um microambiente favorável para a progressão tumoral. Assim, a sinalização purinérgica pode ser considerada como um potencial alvo futuro para o manejo/tratamento do carcinoma papilar de tireoide.