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Navegando PPGBIO - Teses por Autor "d’Azevedo, Pedro Alves"
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Item Atividade antimicrobiana e antivirulência de compostos provenientes de fonte natural(2021) Rossatto, Fernanda Cristina Possamai ; Zimmer, Karine Rigon ; d’Azevedo, Pedro AlvesO resíduo do processamento da uva representa uma fonte importante de compostos renováveis, cuja atividade biológica permanece pouco estudada. Estes resíduos são produzidos em grandes quantidades, podendo causar danos ambientais. Neste sentido, a busca por compostos bioativos com propriedades antimicrobianas e antivirulência nesta matéria-prima é uma alternativa interessante. Uma série de metabolitos secundários – como os compostos fenólicos – são produzidos pela uva, exercendo funções protetivas contra agentes patogênicos. Eles são estratégias promissoras em virtude de sua diversidade estrutural e amplo espectro de propriedades biológicas. Em paralelo, há uma necessidade urgente por novas opções terapêuticas para o controle de infecções causadas por bactérias e fungos, principalmente infecções associadas a biofilmes, as quais são de difícil controle e tratamento. Por estas razões, o presente trabalho teve como objetivo principal a busca por estratégias antimicrobianas e antivirulência – com foco na pesquisa antibiofilme – no controle de infecções bacterianas e fúngicas. Numa primeira etapa, foi investigado o potencial de extratos e frações provenientes do resíduo da uva no controle de biofilmes bacterianos. Para este objetivo, três variedades de resíduos da uva foram coletadas: a uva branca Chardonnay (Vitis vinifera) e as uvas tintas Cabernet Franc (Vitis vinifera) e Bordô (Vitis labrusca). Extração assistida por ultrassom foi conduzida de forma exaustiva com diclorometano, metanol e água. Quatro modelos bacterianos foram utilizados: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa. A atividade antimicrobiana foi mensurada pela obtenção da concentração inibitória mínima (CIM) e por meio da leitura da OD620nm. Possível efeito sinérgico foi verificado através de combinações entre os extratos e antimicrobianos convencionais. A atividade antibiofilme dos extratos a 5 mg/mL foi avaliada através da metodologia do cristal violeta. Os extratos apresentaram valor de CIM entre 1,25 mg/mL e 5 mg/mL contra os microrganismos testados e observou-se efeito sinérgico entre o extrato aquoso da uva Cabernet Franc e o antimicrobiano oxacilina, e extrato aquoso da uva Chardonnay e vancomicina contra os modelos Gram-positivos. O resíduo da uva Chardonnay extraído com diclorometano apresentou os melhores resultados para todas bactérias testadas, inibindo a formação do biofilme sem inibir o crescimento bacteriano. Este extrato foi submetido à cromatografia em coluna de fase normal. Duas frações apresentaram atividade antibiofilme, prevenindo a adesão de S. aureus e S. epidermidis à superfície de poliestireno em 80% a 0,62 mg/mL e inibindo o biofilme de K. pneumoniae em 25% a 0,31 mg/mL. As frações e extratos foram analisados por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (UHPLC-ESI- MS/MS) e indicaram a presença de ácidos graxos, polifenois, alcaloides e aminoácidos. Além disso, a toxicidade dos extratos foi avaliada em modelo invertebrado de Caenorhabditis elegans, demonstrando que os mesmos não afetaram a sobrevivência, tamanho e progenia do nematoide. Numa segunda etapa, os polifenóis ácido elágico (AE) e ácido cafeico fenetil éster (CAPE) foram avaliados quanto às suas atividades antifúngicas contra Candida spp. Para este propósito, os compostos puros foram adquiridos comercialmente e tiveram a atividade antifúngica contra C. albicans SC5314 e um painel de 10 isolados de Candida auris multirresistentes avaliada por microdiluição em caldo e por ensaio do time-kill. AE e CAPE apresentaram valores de CIM ≤ 0,5 μg/mL e entre 1 a 64 μg/mL, respectivamente. AE apresentou efeito fungistático e CAPE fungicida para ambas as espécies de Candida. O mecanismo de ação dos compostos foi investigado pelo ensaio de proteção do sorbitol e pelo ensaio de ligação ao ergosterol, indicando provável ação sobre a parede celular fúngica. CAPE foi capaz de inibir a produção de fosfolipases, biofilmes e filamentação, além de inibir a adesão de C. albicans ou C. auris a células epiteliais do pulmão. AE e CAPE não foram tóxicos a hemácias em todas concentrações testadas (até 64 μg/mL), nem ao modelo in vivo de Galleria mellonella (até 128 mg/kg). Quando G. mellonella foi pré-tratada com AE ou CAPE (32 mg/kg) antes da infecção por C. albicans ou C. auris, a taxa de sobrevivência da larva foi significativamente prolongada, com uma taxa de sobrevivência de 44% para ambos os compostos. Além disso, AE, a 4 μg/mL, prolongou em 40% a sobrevivência do nematoide C. elegans infectado com C. albicans. Em conjunto, estes resultados demonstram o potencial antibacteriano e antifúngico de metabólitos secundários de fonte natural, dentre eles, extratos e frações provenientes do resíduo da uva, e compostos da classe dos polifenóis. Em conclusão, compostos de origem natural representam uma fonte promissora de moléculas antimicrobianas e antivirulência. O desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos a partir destas fontes enseja amenizar a problemática da resistência antimicrobiana e da escassez de opções terapêuticas para o controle de infecções.Item Enterococcus spp. associados a animais marinhos selvagens: genômica comparativa, filogenômica e identificação de moléculas bioativas(Wagner Wessfll, 2020) Prichula, Janira; Seixas, Adriana; d’Azevedo, Pedro Alves; Frazzon, Ana Paula GuedesOs estudos genômicos têm contribuído muito para o entendimento da virulência, da biologia e da evolução das bactérias do gênero Enterococcus. Todavia, o foco tem sido amplamente direcionado às análises comparativas de genomas de linhagens clínicas relevantes, havendo poucos trabalhos sobre enterococos de ecologias selvagens. Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivo realizar uma caracterização em nível genômico de Enterococcus spp. recuperados da microbiota de aves, répteis e mamíferos marinhos selvagens encontrados na costa sul do Brasil. Bibliotecas de DNA genômico de 27 Enterococcus spp. isolados de 17 animais marinhos foram preparadas, e o sequenciamento do genoma foi realizado usando-se a Plataforma Illumina MiSeq e HiSeq. Primeiramente, foi realizado um estudo com as linhagens de Enterococcus spp. provenientes de pinguins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus) e outro estudo relacionando as linhagens provenientes de diferentes aves (Spheniscus magellanicus e Sterna trudeaui), répteis (Chelonia mydas e Eretmochelys imbricata) e mamíferos marinhos (Arctocephalus australis, Grampus griseus e Balaenoptera acutorostrata). Os estudos avaliaram a diversidade genética e a presença de elementos associados ao sucesso de colonização e plasticidade genômica. Foram investigados genes de resistência, virulência, CRISPRs, plasmídeos e genes que codificam moléculas bioativas. Os resultados, obtidos por meio de análises filogenômicas e de genômica comparativa, demonstraram que os enterococos de animais marinhos selvagens apresentam poucos determinantes relacionados à virulência, não estando intimamente relacionados com linhagens clínicas. Algumas espécies de enterococos podem, inclusive, servir como bioindicadores do ecossistema marinho e de impactos antrópicos. Além disso, enterococos associados às espécies marinhas se mostraram uma fonte importante de novos compostos para aplicação biotecnológica. Foi encontrado um número expressivo de agrupamentos de genes relacionados a moléculas antimicrobianas, sendo os mais abundantes os que codificam bacteriocinas, seguidos pelos envolvidos em rotas de síntese de terpenos e de peptídeos não ribossomais (NRPS). Trinta diferentes bacteriocinas pertencentes a diferentes classes foram descritas, incluindo oito novas moléculas com potencial bioativo a ser investigado. A caracterização em nível genômico possibilitou, também, a identificação de dois isolados, um pertencente à espécie E. avium e outro da espécie E. mundtii, com potencial probiótico. Dessa forma, o grande número de informações geradas por este trabalho pode ser explorado em vários aspectos, incluindo desde propósitos ambientais, ecológicos e evolutivos até biotecnológicos, como a identificação de potenciais linhagens probióticas e a elucidação de novos compostos bioativos.