PPGBIO - Teses

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Navegando PPGBIO - Teses por Autor "Fiegenbaum, Marilu"

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    Aspectos moleculares e clínicos do sistema Rh em doadores de sangue e na Doença Hemolítica do Feto e do Recém-nascido
    (2024) Rodrigues, Mirelen Moura de Oliveira; Fiegenbaum, Marilu; Almeida, Silvana de; Programa de Pós-Graduação em Biociências
    Introdução: O sistema Rh é um dos mais importantes sistemas de grupos sanguíneos, pois é considerado altamente imunogênico e polimórfico. Dois genes codificam os antígenos do sistema Rh, RHD e RHCE, sendo os mais importantes os antígenos D, C, c, E, e. O desenvolvimento de anticorpos contra antígenos do sistema Rh está associado a reações transfusionais hemolíticas imediatas e tardias e a Doença Hemolítica do Feto e do Recém-nascido (DHFN). No âmbito da imunohematologia, as técnicas de sequenciamento de DNA podem ser muito úteis para elucidar casos de discrepâncias entre genotipagem e fenotipagem e para identificação de novas variantes de grupos sanguíneos. Objetivos: Compreender as discrepâncias entre os resultados de genotipagem e fenotipagem para os antígenos C/c, E/e em amostras de doadores de sangue do Hospital de Clínicas de Porto Alegre utilizando o sequenciamento das regiões codificantes e adjacentes dos genes RHD e RHCE com discrepância, avaliando a presença de possíveis variantes que expliquem a discrepância. Devido à grande importância dos antígenos do sistema Rh no desenvolvimento da DHFN, a tese também tem como objetivo realizar uma busca sistemática na literatura sobre o tema DHFN e a frequência de anticorpos antieritrocitários em gestantes descrevendo mais prevalentes. Método: O presente estudo avaliou 395 amostras fenotipadas e genotipadas para os antígenos C/c e E/E de doadores de sangue do Hospital de Clínicas, dentre estas foram avaliadas quais amostras apresentaram discrepâncias entre genótipo e fenótipo para os alelos RHCE*e/*E (rs609320) e RHCE*c/*C (rs676785). A fenotipagem foi realizada utilizando a metodologia de tubo com antissoros monoclonais e a genotipagem através da técnica de PCR em tempo real utilizando sistema TaqMan®. As amostras discrepantes para os dois alelos foram sequenciadas utilizando 20 pares de primers para abranger as regiões codificantes e adjacentes dos éxons dos genes RHD e RHCE. As reações de sequenciamento foram realizadas pelo método Sanger. Também foi realizada uma busca sistemática na literatura sobre o desenvolvimento de DHFN e a presença aloimunização em gestantes. O estudo foi conduzido sob aprovação do CEP da UFCSPA (nº 2.753.780). Resultados: Dentre as 395 amostras avaliadas para as metodologias de genotipagem e fenotipagem, 15 apresentaram discrepância entre genótipo e fenótipo para os dois alelos investigados concomitantemente, em duas amostras a análise do sequenciamento confirmou o resultado obtido na genotipagem para o alelo RHCE*E/*e. Foram identificadas variantes, que possivelmente possam explicar as discrepâncias nestas amostras. Dentre as variantes encontradas, duas ainda não estão descritas. Utilizando ferramentas de análise in silico foi possível observar que as variantes podem apresentar potencial de causar alterações na expressão da proteína RhCE e, consequentemente, na expressão dos alelos. A variante encontrada no éxon 6 do gene RHCE foi classificada como “provável dano” utilizando o software PolyPhen-2 com score de 0,999 (sensibilidade = 0,99) e classificada como “tolerada” pelo software SIFT. A segunda nova variante descrita, localizada no final do íntron 7 do gene RHCE, utilizando o software RegulomeDB foi obtido um score de 1,0 o que significa que a nova variante pode alterar a ligação e à expressão gênica. A partir da busca sistemática sobre DHFN e aloimunização, revisamos 75 artigos publicados, ao total 13.966 gestantes apresentavam aloimunização. Os anticorpos mais prevalentes neste estudo de revisão do sistema foram, anti-D (35,01%), anti-K (14,69%), anti-E (11,21%), anti-c (5,48%), anti-C (4,93%) e anti-M (2,35%). Conclusão: Embora o genótipo seja preditor do fenótipo, há algumas situações em que expressão gênica é alterada, como por exemplo, no sistema Rh a presença de antígenos fracos e parciais. Nosso estudo contribui com a identificação de novas variantes que possivelmente podem ter influência na expressão da proteína RhCE. Em relação a DHFN, embora o anti-D ainda seja o anticorpo mais frequente associado a DHFN, podemos observar que outros anticorpos contra antígenos dos sistemas Rh, Kell e MNS apresentam grande prevalência, principalmente, o anti-K e anti-E. Sendo assim, há a necessidade de atentar para a DHFN com o entendimento de que outros anticorpos contra antígenos de grupos sanguíneos estão associados ao desencadeamento da doença implicando em anemia com implicação leve a grave e inclusive no óbito do feto ou recém-nascido e de que é necessário identificar e acompanhar a gestantes com risco de incompatibilidade materno fetal.
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    Avaliação da variabilidade genética de selenoproteínas na suscetibilidade ao carcinoma hepatocelular
    (2021) Alves, Andressa de Freitas; Almeida, Silvana de; Fiegenbaum, Marilu; Giovenardi, Márcia
    Introdução: O carcinoma hepatocelular é uma neoplasia primária do fígado, classificada como a terceira causa de morte por câncer no mundo. Qualquer condição que leve a uma doença hepática crônica, configura-se como um agente oncogênico em potencial. O estresse oxidativo é uma das condições estudadas devido à ligação entre o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e danos ao DNA. As selenoproteínas, por sua vez, desempenham papel antioxidante no corpo, combatendo esse efeito. Alterações na estrutura e/ou expressão dessas proteínas podem estar ligadas à suscetibilidade do organismo aos efeitos do estresse oxidativo, incluindo a carcinogênese. Objetivo: Avaliar a influência da variabilidade genética e da expressão das selenoproteínas na suscetibilidade ao carcinoma hepatocelular. Metodologia: Foram realizados dois estudos. No primeiro estudo foi avaliada a expressão gênica de enzimas antioxidantes (GPX1, GPX4, SEP15, SelP, SOD1, SOD2, GSR, CAT e NRF2) em tecidos tumorais e não tumorais de pacientes com CHC, além de pacientes saudáveis. As análises foram realizadas experimentalmente por RT-qPCR em pacientes com carcinoma hepatocelular e por bioinformática em pacientes dos bancos de dados TCGA e GTEx. No segundo estudo foi realizada a genotipagem por qPCR dos SNPs GPX1 rs1050450, GPX1 rs3448, GPX4 rs713041, SEP15 rs5845, SEP15 rs5859, SELENOP rs7579 e SELENOP rs3877899 em pacientes caso e controle, assim como foi realizada em pacientes do TCGA por ferramentas de bioinformática. As taxas de perda de heterozigosidade estimada foram calculadas pelo pacote de R HWE-LOH. Ambos os estudos foram aprovados pelo CEP da UFCSPA (no 2.400.119 e no 2.315.844). Resultados: As análises de bioinformática detectaram diferença significativa entre os grupos caso x controle e tumor x peritumor na expressão de grande parte dos genes estudados. Em comparação ao tecido peritumoral, a expressão de GPX4 estava aumentada (p=0,02) e a de SOD2 diminuída (p=0,04) no tecido tumoral nos dados experimentais. A baixa expressão de GPX1 (p=0,006), GPX4 (p=0,01), SELENOP (p=0,006), SOD1 (p=0,007), CAT (p<0,001), e NFE2L2 (p<0,001), e alta expressão de GSR (p<0,001), foram associados com menor sobrevida em 12 meses nos pacientes do TCGA. Além disso, foram encontradas diferenças significativas nas frequências genotípicas de todos os SNPs estudados, exceto para o rs3448, entre casos e controles (p<0.05), na amostra experimental. Tanto a amostra experimental quanto os dados do TCGA apresentaram tendência a perda do genótipo heterozigoto em amostras tumorais, sendo que as análises de perda heterozigosidade estimada revelaram taxas variadas (8-41%) nas mesmas amostras. A perda de heterozigosidade para o SNP rs713041 do gene GPX4 foi associada com características clínico-patológicas como a etiologia (consumo de álcool, p=0,04) e o grau histológico (tumores pouco diferenciados, p=0,02). Conclusões: Tanto alterações na expressão gênica quanto nos genes de selenoproteínas parecem ter papel importante no desenvolvimento e progressão do carcinoma hepatocelular.