Desenvolvimento de metodologias para a implementação do sequenciamento do Farmacogene CYP2D6

Abstract

A farmacogenômica investiga a influência da variabilidade genética na resposta a medicamentos, constituindo uma ferramenta fundamental para a implementação da medicina de precisão. Entre os farmacogenes de maior relevância clínica destaca-se o CYP2D6, responsável pela metabolização de aproximadamente 25% dos fármacos utilizados na prática clínica. Entretanto, sua elevada complexidade genética, caracterizada pela presença de múltiplas variantes de ponto, variações estruturais e alta homologia com pseudogenes adjacentes, representa um desafio para sua caracterização molecular por metodologias convencionais de genotipagem. Nesse contexto, tecnologias de sequenciamento por long reads surgem como alternativas promissoras para a análise abrangente desse gene. O presente estudo teve como objetivo desenvolver e avaliar estratégias de preparo de bibliotecas genômicas para o sequenciamento do CYP2D6 utilizando a plataforma MinION Oxford Nanopore. Foram avaliadas duas abordagens de enriquecimento da região alvo: clivagem direcionada por CRISPR-Cas9 baseada no protocolo nanopore Cas9-targeted sequencing (nCATS e amplificação por PCR Long-Range. Para a realização desta pesquisa, amostras provenientes do banco da Rede Nacional de Farmacogenética (REFARGEN) foram submetidas a etapas de triagem e purificação para seleção de DNA genômico com qualidade adequada. Os experimentos permitiram estabelecer e adaptar protocolos para ambas as estratégias de enriquecimento, bem como identificar etapas críticas relacionadas à amplificação de fragmentos de grande extensão, à purificação de DNA de alto peso molecular e à implementação da metodologia nCATS. Embora os resultados obtidos não tenham permitido a validação conclusiva das abordagens propostas, os dados gerados forneceram subsídios importantes para a otimização dos protocolos e para a futura implementação do sequenciamento do CYP2D6 por long-reads. Os achados reforçam o potencial das tecnologias de sequenciamento de terceira geração para a caracterização de farmacogenes complexos e evidenciam a importância do desenvolvimento de metodologias adaptadas à diversidade genética da população brasileira.