Fiegenbaum, MariluDeconte, Desirée2025-02-282025-02-282024-09-06https://repositorio.ufcspa.edu.br/handle/123456789/3238Tese (Doutorado)-Programa de Pós-Graduação em Patologia, Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.Introdução: As doenças monogênicas representam um grupo extenso de alterações fenotípicas que afetam a população mundial: existem, hoje, cerca de 7.000 doenças monogênicas conhecidas. Apesar de extensas investigações para elucidar a etiologia molecular específica de doenças raras, a identificação de genes relacionados a elas são, ainda, escassos. Com a etiologia desconhecida, o diagnóstico para a maioria dos pacientes com suspeita de alguma condição monogênica rara continua imprecisa. Sendo assim, a necessidade de buscar o diagnóstico e a caracterização molecular para esses pacientes é essencial para estabelecer correlações entre o genótipo e o fenótipo, melhorar o manejo e o tratamento destes pacientes e para possibilitar a identificação de fatores etiológicos e prognósticos para um aconselhamento familiar mais preciso. Objetivos: Realizar a avaliação molecular de pacientes com suspeita clínica de diferentes alterações monogênicas raras associadas aos genes CHST3, EDNRB, FGFR2, FOXC2, KIAA0586, NFIX e SOX9, bem como realizar a predição in silico das variantes encontradas. Material e Métodos: O DNA de todos os pacientes e seus respectivos progenitores foi isolado pelo método de salting-out e amplificado pelo método de reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional com o primers desenhados para cobrir todas as regiões codificantes dos genes. O sequenciamento das amostras foi realizado através do sequenciador automático ABI-PRISM 3130 Genetic Analyzer e os eletroferogramas gerados analisados com o auxílio do programa Chromas Lite. Para as análises in silico serão usadas à nível gênico as 25 ferramentas recomendadas pelas Diretrizes para Interpretação de Variantes de Sequências da ACMG quanto às análises preditivas para troca de sentido, alteração de sítios de splicing e conservação de nucleotídeos. No nível protéico, os quatro níveis hierárquicos de sua estrutura serão avaliados Além disso, algoritmos de predição estipulados pela American College of Medical Genetics and Genomics e a Association for Molecular Pathology serão utilizados para realizar a avaliação dos critérios de patogenicidade das variantes encontradas a nível populacional, de estrutura proteica e conservação evolutiva. Resultados: Foram encontradas variações de sequência nos genes CHST3, EDNRB, FGFR2, KIAA0586 e NFIX. No paciente diagnosticado com displasia esquelética foi encontrada uma nova variante missense em homozigose no gene CHST3 por NGS, confirmada, posteriormente, por sequenciamento de Sanger. Alterações no gene FGFR2 foram encontradas tanto para o indivíduo diagnosticado com síndrome de Pfeiffer, quanto para o paciente com síndrome de Apert. Na síndrome de Pfeiffer, uma variante missense de novo foi encontrada na região de sítio aceptor de splicing entre os exons 8 e 9. Para a síndrome de Apert, outra variante missense de novo em heterozigose foi encontrada. Ainda, uma nova variante também foi identificada no indivíduo com síndrome de Marshall-Smith: duplicação de sete nucleotídeos no éxon 8 do gene NFIX . Para o paciente com diagnóstico de síndrome de Shah-Waardenburg foi encontrada uma variante missense em homozigose no gene EDNRB. A análise do painel de genes para ciliopatias identificou uma variante em KIAA0586 herdada do pai no paciente diagnosticado com síndrome de Hydrolethalus. Ainda, uma análise por rtPCR encontrou uma possível variante intrônica também no gene KIAA0586 na amostra materna, possivelmente herdada pela filha. Por fim, para os genes FOXC2 e SOX9 não foi encontrada nenhuma mutação no sequenciamento dos respectivos pacientes. Conclusão: Neste trabalho foi avaliado um único paciente com suspeita de doença monogênica rara para cada gene associado ao respectivo fenótipo. Apesar de nossa análise molecular cobrir toda a região codificante dos genes, para dois destes pacientes não foi observada nenhuma mutação. Para os demais casos, foram observadas duas mutações previamente descritas para pacientes com craniossinostoses (rs1057519041 e rs77543610) e quatro variantes novas. Para as mutações novas, análises in silico foram realizadas para auxiliar na elucidação da probabilidade de dano ao genoma, bem como na predição da proteína alterada e, ainda, na compreensão do funcionamento do gene investigado. Estes resultados reforçam a existência de uma heterogeneidade genética entre casos de mesmo diagnóstico clínico, bem como a importância do diagnóstico molecular para cada paciente de forma a fornecer um diagnóstico completo mais efetivo e preciso e um aconselhamento genético mais personalizado.pt-BRAttribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0 BrazilDoença monogênicaAnálise in silicoGene[en] Monogenic disease[en] In silico assessment[en] GeneTese